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以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)北美株感染性克隆为平台进行反向遗传操作,利用突变PCR将5'非翻译区(5'UTR)中部分一级序列进行系列突变,以改变5'UTR二级结构中的一保守茎部结构,从而解析PRRSV 5'UTR中结构与功能的关系.通过DNA转染MARC-145细胞观察突变体克隆的感染性,并通过免疫荧光及Northern blot来研究拯救后突变病毒的复制、转录特性,以及通过空斑形态学分析突变病毒的生长特性.结果表明,PRRSV 5'UTR中保守茎部结构的二级结构与病毒的拯救无直接关系,但其一级核苷酸序列却是PRRSV病毒复制所必需的,作者还找到直接调控病毒复制的核心位点.由此证实了5'UTR中调控PRRSV复制过程的必需序列,为进一步解析PRRSV复制过程的调控元件奠定了基础. 相似文献
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《畜牧兽医学报》2010,(11)
以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)北美株感染性克隆为平台进行反向遗传操作,利用突变PCR将5′非翻译区(5′UTR)中部分一级序列进行系列突变,以改变5′UTR二级结构中的一保守茎部结构,从而解析PRRSV5′UTR中结构与功能的关系。通过DNA转染MARC-145细胞观察突变体克隆的感染性,并通过免疫荧光及Northern blot来研究拯救后突变病毒的复制、转录特性,以及通过空斑形态学分析突变病毒的生长特性。结果表明,PRRSV5′UTR中保守茎部结构的二级结构与病毒的拯救无直接关系,但其一级核苷酸序列却是PRRSV病毒复制所必需的,作者还找到直接调控病毒复制的核心位点。由此证实了5′UTR中调控PRRSV复制过程的必需序列,为进一步解析PRRSV复制过程的调控元件奠定了基础。 相似文献
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在PRRSV感染性克隆pCBC2的基础上,通过突变PCR获得了病毒基因组5'UTR系列缺失的全长突变体克隆:pCBCM1、pCBCM3、pCBCM5、pCBCM7、pCBCM9、pCBCM45、pCBCM69、pCBCM100,随后将上述突变体体外转录成RNA之后转染MARC-145细胞,进行病毒感染性、复制和转录分析,以鉴定特定的缺失区的调控功能.结果显示,病毒5'UTR起始的第1个碱基是保持病毒感染性非必需的核苷酸;前45个碱基对病毒基因组的复制是非必需的.Northern-Blot结果显示pCBCM1亚基因组mRNA可以进行高效率的转录.而其余突变体的亚基因组转录受到严重抑制.由此证明,PRRSV 5'UTR的完整性对病毒意义重大,碱基的少量以及大部分缺失会对病毒产生极大的影响. 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reporoductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）基因组5′非翻译区（untranslated region,UTR）对病毒复制转录等过程至关重要,但其发挥作用的机制尚不清楚。本实验室将欧洲型PRRSV 5′UTR替换入北美型PRRSV弱毒株感染性克隆pAPRRS的骨架中,构建pAPLV5。经过DNA转染入MARC-145细胞系中,两次传代后,拯救出嵌合病毒vAPLV5。通过对嵌合病毒的全长测序发现,嵌合病毒基因组较亲本病毒发生了碱基突变,突变主要集中于Nsp2和Nsp9位置。将Nsp9位置（病毒的RNA依赖的RNA聚合酶,RNA-dependent KNA povymerase,RdRp）的4处突变位点引入嵌合病毒的感染性克隆pAPLV5,所构建的4个突变嵌合克隆转染MARC-145细胞后无需传代即产生细胞病变（cytopathic effect,CPE）,且P0代病毒滴度较原嵌合病毒vAPLV5高。通过半定量负链和亚基因组检测发现,突变嵌合病毒的RNA合成水平也较亲本嵌合病毒高。由此推测PRRSV 5′UTR功能可能与RdRp相关,异源的5′UTR通过突变RdRp来发挥其调控作用,完成病毒拯救过程。 相似文献
7.
人们广泛认为动脉炎病毒的基因组5’非翻译区(untranslated region,UTR)在病毒基因组RNA复制、亚基因组mRNA转录和蛋白翻译过程中发挥关键作用,然而其结构与功能仍然在很大程度上不为人知。现基于2型猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染性克隆pAPRRS的基础,构建了一系列5’UTR的5’末端缺失突变体,利用RNA和DNA转染,分析了拯救病毒的遗传学与病毒学特征,发现拯救病毒的5’末端突变位点被一些不知来源的AU-rich外源序列所修复。基于T7启动子与CMV启动子转录起始位点的不同,我们人为引入一段GC-rich的序列以研究病毒的自我修复是否为模板依赖性,结果发现病毒的外源序列修复机制是非模板依赖的。通过二级结构预测分析发现,在PRRSV5’UTR中的第一个茎环结构是病毒感染性必不可少的。 相似文献
8.
《中国预防兽医学报》2019,(8)
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)3'-非编码区(UTR)在病毒复制过程中具有重要作用,本研究经序列比对发现,与经典PRRSV相比,高致病性PRRSV(HP-PRRSV)3'-UTR中第17位碱基G(鸟嘌呤)发生缺失。为进一步探究3'-UTR中该碱基缺失对3'-UTR二级结构和PRRSV复制效率的影响,本研究在HP-PRRSV HuN 4感染性克隆株的基础上,将缺失碱基补平,得到突变病毒HuN 4-3'-UTR-(17+G)。复制动力学结果显示突变病毒HuN 4-3'-UTR-(17+G)在48 h和96 h病毒滴度均较亲本病毒HuN 4株显著降低(p0.05),表明3'-UTR第17位碱基G的缺失增强了HP-PRRSV的复制能力;同时第17位碱基对应的茎环区域的缺失不影响病毒拯救,其还可以作为标记疫苗的分子标签。本研究结果为进一步探究PRRSV复制的分子机制奠定了基础。 相似文献
9.
人们广泛认为动脉炎病毒的基因组5′非翻译区（untranslated region,UTR）在病毒基因组RNA复制、亚基因组mRNA转录和蛋白翻译过程中发挥关键作用,然而其结构与功能仍然在很大程度上不为人知。现基于2型猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）感染性克隆pAPRRS的基础,构建了一系列5′UTR的5′末端缺失突变体,利用RNA和DNA转染,分析了拯救病毒的遗传学与病毒学特征,发现拯救病毒的5′末端突变位点被一些不知来源的AU-rich外源序列所修复。基于T7启动子与CMV启动子转录起始位点的不同,我们人为引入一段GC-rich的序列以研究病毒的自我修复是否为模板依赖性,结果发现病毒的外源序列修复机制是非模板依赖的。通过二级结构预测分析发现,在PRRSV5′UTR中的第一个茎环结构是病毒感染性必不可少的。 相似文献
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根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5'端非编码区基因序列,设计合成了1对特异性引物,参考本实验室针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白设计的引物,经过PCR反应条件的优化,建立了BVDV和PRRSV双重RT-PCR的检测方法。对于PRRSV和BVDV的cDNA最低检测量分别为3.8×10-4 ng和7×10-4 ng,对于猪瘟病毒(CFSV)、脑心肌炎病毒(EMCV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的PCR扩增结果均为阴性;用该方法对江苏省不同地区采集的75份仔猪的肺脏、脾脏和淋巴结等病料进行了检测,结果PRRSV有55份阳性,BVDV有14份阳性,PRRSV和BVDV混合感染的有12份,与PRRSV和BVDV单一RT-PCR的检测结果符合率分别为89.3%和92%。证明建立的双重RT-PCR检测方法可用于临床样品中BVDV和PRRSV的检测。 相似文献
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为探究猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的N蛋白磷酸化修饰是否对病毒的复制及亚基因组的转录产生影响，将XH-GD PRRSV N蛋白的已知磷酸化位点Ser-105和Ser-120分别或同时突变为Ala，拯救突变病毒，命名为A105、A120、A105-120，测定其生长曲线和亚基因组的转录水平。结果显示：突变病毒在MARC-145的病毒复制速率与滴度显著低于亲本毒株（P<0.01或P<0.05），而在原代PAMs复制速率降低（P<0.01），不影响病毒最终的滴度。突变毒株的基因组RNA（genomic RNA，gRNA）转录水平显著降低（P<0.01或P<0.05），磷酸化位点突变能显著降低长链亚基因组mRNA（subgenomic RNA，sgmRNA）2、3的转录（P<0.01或P<0.05），但短链sgmRNA4、5表达量随时间呈增加趋势。以gRNA表达量为基准对各亚基因组表达量进行整体分析，发现N蛋白磷酸化显著影响了sgmRNA4和sgmRNA5的表达（P<0.01或P<0.05）。结果提示，N蛋白磷酸化位点突变影响PRRSV的复制及亚基因组转录。 相似文献
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The nonstructural protein 2 (nsp2) of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) has been shown to be highly heterogeneous and variable among PRRSV strains and some sequences in the middle region of the nsp2 are not essential to viral replication. Recent studies have attempted to insert foreign genes in the nsp2 nonessential regions but the foreign genes were not stably expressed by recombinant viruses in vitro. In the present study, we first constructed an infectious cDNA clone with deletion of 75 nucleotides (25 amino acids) in the nsp2 region (rHuN4-F112-Δ508-532) of the attenuated vaccine virus HuN4-F112 derived from a highly pathogenic PRRSV HuN4 and then inserted a gene fragment encoding a immunodominant B-cell epitope (49 amino acids) of Newcastle disease virus (NDV) nucleoprotein (NP) in-frame into the deletion site. The viable recombinant virus was rescued from the full-length cDNA infectious clone in vitro. The engineered viruses rescued from the cDNA clone indicated that the deletions of 75 nucleotides and insertion of NDV NP gene in the nsp2 region did not affect viral replication; they had similar growth kinetics to its parental virus. The inserting gene could be expressed consistently when the recombinant virus was passaged up to twenty times in cell cultures as determined by immunofluorescence assay (IFA) and genomic sequencing. To investigate the potential application of the NDV NP gene-inserted PRRSV as a marker vaccine, piglets were immunized with the recombinant virus and then challenged with lethal dose of highly pathogenic PRRSV. The immunized piglets produced specific antibodies against both the NDV NP and PRRSV, and lacked antibodies against the deleted 25aa nsp2 epitope. After challenge, all immunized piglets were protected from clinical disease or death, while all piglets in control group died (5/5) by ten days post challenge. The results of the present study indicated that the recombinant PRRSV (rHuN4-F112-Δ508-532) could be used as a potential marker vaccine against PRRS. 相似文献
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为了解细环病毒(Torque teno virus,TTV)在广西猪群中的感染情况,本研究运用Nest-PCR方法,对2009—2011年采自广西140个规模猪场的156份血液、流产胎儿及肺脏、脾脏、肾脏、肝脏、淋巴结等组织样品进行检测,并对阳性样品的非编码区(UTR)进行克隆测序及遗传进化分析;同时对部分样品进行猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、典型猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)检测及细菌的分离鉴定。结果发现,广西猪群中TTV总感染率达到93.6%,TTV2的感染率(76.9%)不仅明显高于TTV1(16.7%),且毒株间遗传变异较大。TTV多与PCV2和PRRSV混合感染,且以与PRRSV混合感染率更高(64.29%)。猪群中存在2重、3重,甚至4重TTV与其他病毒的混合感染。临床上TTV与细菌的混合感染(或细菌继发感染)以链球菌和副猪嗜血杆菌多见。本研究证实在广西猪群中存在TTV感染,且存在普遍的TTV与PRRSV、PCV2和CSFV混合感染。 相似文献
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为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)5'端非病毒核苷酸对感染性克隆拯救的影响,优化PRRSV反向遗传操作平台,本试验构建了含有CMV启动子的PRRSVJXA1-R株全长克隆质粒,在CMV启动子的下游引入锤头核酶序列,并在PRRSV基因组的5'端上游和锤头核酶下游之间引入非病毒核苷酸,分别构建成5'端含有非病毒核苷酸GG和GCTAGC的PRRSV全长感染性cDNA克隆Pgg-PRRSV和PNhe-PRRSV。新构建的两株克隆质粒直接转染BHK-21细胞拯救,48h后用间接免疫荧光检测病毒M蛋白,结果表明两株克隆均可拯救成活,测定Pgg-PRRSV和PNhe-PRRSV转染上清的病毒毒价分别为3.0和1.25TCID50/mL,拯救病毒在Marc-145细胞上传3代后均稳定在6.5TCID50/mL,病毒滴度无明显差异。本研究成功构建了两株5'端上游含有非病毒核苷酸的PRRSV基因组全长感染性cDNA克隆,表明PRRSV的5'端上游含有两个非病毒核苷酸GG拯救效率较高,且5'端的病毒外源核苷酸对拯救的影响仅存在于拯救的最初阶段。 相似文献
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为构建表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白重组猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV),本研究首先利用高致病性PRRSV弱毒疫苗HuN4-F112株的感染性分子克隆作为平台,构建了一个在nsp2区有缺失的感染性分子克隆,命名为pHuN4-F112-△480-620。以pHuN4-F112-△480-620作为载体,采用突变PCR的方法将CSFV的主要保护性抗原E2基因1 bp～9 99 bp,1 bp～600 bp,1 bp～330 bp及256 bp～330 bp基因片段分别插到nsp2中aa 480～aa 620位氨基酸缺失编码区域。结果显示,插入完整E2基因或较大E2基因片段的重组PRRSV cDNA质粒均未能拯救出病毒,只有插入较小的E2基因片段(256 bp～330 bp)的重组病毒cDNA质粒成功地拯救出了重组病毒rPRRSV-F112-E2(256-330),拯救的病毒能够在MARC-145细胞上引起明显的细胞病变,而且生长速度明显高于其亲本病毒,间接荧光检测表明该重组病毒能够表达外源基因。 相似文献