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1.
利用间接荧光抗体技术对微小隐孢子虫Cp16蛋白进行抗原定位 总被引：1，自引：0，他引：1
Cp16基因是从核糖体展示文库中筛选的微小隐孢子黏附相关基因,为了确定Cp16蛋白是否是微小隐孢子虫卵囊或子孢子表面抗原,构建了Pet-28 a-Cp16原核表达载体,将其转化至BL21大肠杆菌中进行诱导表达,经纯化获得重组蛋白Cp16。将纯化的重组蛋白免疫BAILB/c小鼠,ELISA方法测定IgG抗体滴度。利用间接荧光抗体技术进行抗原定位的初步研究。结果表明:隐孢子虫卵囊表面及子孢子表面富含Cp16蛋白。 相似文献
2.
斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
利用原核表达系统克隆表达斑马鱼p53基因。RT-PCR法从斑马鱼胚胎中扩增获得p53基因编码区,并将其克隆至原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a/z-p53,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)受体菌,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化、尿素透析复性,SDS-PAGE电泳分析,结果表明,p53基因在大肠杆菌中成功表达,表达的p53融合蛋白分子量大约为53kD,透析复性后获得了高纯度可溶性的p53蛋白。 相似文献
3.
以稻褐飞虱的cDNA为模板,进行PCR扩增,获得约1 900 bp的DNA片段.通过T-A克隆,将PCR产物插入pMD18-T载体中.再以此重组载体为模板,以羧酸酯酶成熟蛋白基因(cae-M)的特异性引物进行PCR扩增.将cae-M扩增产物和pET28a分别用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,酶切产物纯化后在T4连接酶作用连接成重组表达载体pET28a-cae-M.将pET28a-cae-M转化BL21(DE3),经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约62 kD外源蛋白带.蛋白质印迹分析表明,该外源蛋白与6×His融合表达. 相似文献
4.
采用SOE法人工设计和合成抗菌肽MagaininⅡ基因,定向克隆至表达载体pET 28a,将构建的重组质粒pET 28a-Mag转化至E.coliBLP,Amp抗性筛选的阳性克隆用IPTG诱导融合表达。利用Tricine-SDS-PAGE确定了产物的正确性,利用琼脂孔穴扩散法证明表达产物具有抗菌活性。 相似文献
5.
[目的]克隆南方菜豆花叶病毒(SBMV)外壳蛋白(CP)基因,并对其进行原核表达。[方法]利用RT-PCR方法克隆SBMV CP基因,将CP基因定向插入表达载体pET28a中,构建其表达载体,并转化大肠杆菌BL-21表达重组蛋白。[结果]试验成功克隆到大小为799 bp的SBMV CP基因,测序分析发现与NCBI中目标基因的相似度达99%以上;成功构建了该基因的原核表达载体pET28a-SBMVCP,并确定重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG、4 h条件下表达量最大。[结论]该研究为SBMV抗体的制备奠定了基础。 相似文献
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【目的】克隆和表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)bioI基因并纯化表达产物。【方法】提取B.sub-tilis1A747基因组DNA,从中扩增bioI基因并将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)的表达载体pET-28a(+)上,构建bioI的表达载体pET28a-bioI。将重组质粒pET28a-bioI电转化到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,对表达产物BioI用Ni2+-NAT亲和层析树脂进行纯化,并对纯化蛋白进行波长扫描。【结果】成功构建了表达载体pET28a-bioI,酶切鉴定结果正确并在大肠杆菌中表达成功,经IPTG诱导8 h后,重组蛋白BioI的表达量占总可溶性蛋白的20%;波长扫描发现,重组蛋白BioI在400 nm处有特征吸收峰。【结论】bioI基因克隆表达成功,其表达产物BioI具有P450蛋白的特征,为蛋白性质的进一步研究和抗体的制备奠定了基础。 相似文献
7.
克隆了堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)乳酸脱氢酶(LDH)基因(EaLDH),并在大肠杆菌中成功表达出重组蛋白.根据GenBank中收录的EaLDH核苷酸序列设计特异性引物,以其第一代裂殖体总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增获得EaLDH基因.将EaLDH基因片段与原核表达载体pET28a(+)连接,构建重组表达质粒pET28a(+)-LDH,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达.结果表明,扩增出的EaLDH基因含993 bP的开放阅读框,与GenBank中收录的EaLDH基因序列相似性为98%.诱导后,重组蛋白能够在大肠杆菌中高效表达,融合蛋白相对分子质量约为4.1×104. 相似文献
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将克隆质粒pMD-18T-H和pMD-18T-F分别进行双酶切,获得纯化的H基因和F基因,在T4DNA连接酶的作用下,亚克隆到原核表达载体pET28a(+)上,获得原核重组质粒pET28a-H和pET28a-F.将原核重组质粒转化大肠埃希菌Escherichia coli Rosetta2(DE3)中进行表达,SDS-PAGE结果显示H基因和F基因分别表达相对分子质量约为31 400和38 200的融合蛋白,Western-blot检测结果显示,表达蛋白均可与CDV标准阳性血清呈阳性反应,表明原核表达的CDV H蛋白和F蛋白在反应原性上具有与天然H蛋白和F蛋白同样的特性,可作为CDV诊断用抗原,为CDV的免疫预防研究奠定基础. 相似文献
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根据GenBank上登录的红笛鲷SR-BI基因设计引物,采用RT-PCR方法扩增该基因胞外段序列,然后将该基因胞外段序列定向克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,将重组质粒转入大肠杆菌BL21进行IPTG诱导表达,并对重组表达菌株的表达条件进行优化.结果显示,成功构建了原核表达载体pET28a-SR-BI,并能在大肠杆菌BL21中表达,表达的融合蛋白分子量为50.0ku.融合蛋白的最佳诱导表达温度、IPTG浓度和时间分别为16℃、0.05mmol/L和8h.研究结果为进一步研究SR-BI的功能奠定了基础. 相似文献
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从ConA活化的昆明小鼠脾细胞中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增得到小鼠的IL-10基因.编码序列经测序验证后,将其克隆入表达载体pET-28a,构建IL-10基因的重组原核表达载体,在大肠杆菌(DE3)中诱导表达目的蛋白.SDS-PAGE结果表明,该表达产物的分子量与预期值相符,Western blot结果说明小鼠IL-10基因得到了表达. 相似文献
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以重组克隆载体pGEM—T—hsbp1为模板,PCR扩增hsbp1,用限制性内切酶双酶切、T4连接酶连接、转化BL -21的方法构建pGEX-2TK-hsbp1原核表达载体,实现了hsbp1在BL21中的表达,SDS—PAGE检测表达的融合蛋白主要以可溶形式存在,并利用亲和层析得到融合蛋白。 相似文献
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为观察重组MPB83蛋白的免疫活性,揭示该蛋白在牛结核病的诊断和防治中的作用,克隆了牛分枝杆菌MPB83基因,构建了克隆载体pGEM-MPB83和表达载体pET30a-MPB83,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并进行蛋白纯化。试验结果表明:牛分枝杆菌MPB83基因体外扩增产物与预期值相符,约600 bp;所构建表达质粒pET30a-MPB83经测序,结果与预期一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以包涵体的形式表达,其分子质量约为26 ku,蛋白表达量占菌体总蛋白的20%;该蛋白经电洗脱纯化后,纯度达95%以上;免疫印迹分析表明,原核表达的融合蛋白可与兔抗牛分枝杆菌多克隆抗体结合,并且具特异的免疫反应性。 相似文献
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根据GenBank中新城疫病毒(NDV)F48E9株F1基因序列和原核表达载体pET-28a的克隆位点,设计1对引物,通过PCR方法获得了F1基因;将F1双酶切产物插入原核表达载体pET-28a,得到的重组子命名为pET-F1。用IPTG进行诱导将其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,结果表明,NDV F1在pET-F1中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子质量约为31 ku。表达的重组蛋白为进一步研究NDV的免疫特性和分子生物学功能奠定了基础。 相似文献
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牛双芽巴贝斯虫热休克蛋白基因外显子的克隆与原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
从患牛焦虫病的牛全血样品中抽提总RNA,通过设计特异性引物,经RT-PCR扩增牛双芽巴贝斯虫热休克蛋白20（HSP20）基因的外显子,将其插入pMD18-T载体进行测序、鉴定,构建原核表达质粒载体PGEX-4T-2-HSP20（exon）。试验结果显示牛双芽巴贝斯虫HSP20基因外显子已被成功克隆。该基因的外显子序列与国际标准株HSP20外显子的序列存在两个碱基的突变,导致其编码的蛋白质出现了一个氨基酸的变异。测序结果还表明,克隆出的牛双芽巴贝斯虫HSP20基因外显子已正向插入原核质粒表达载体PGEX-4T-2,成功构建了PGEX-4T-2-HSP20（exon）表达载体,并在大肠杆菌BL21（DE3）中的得到表达。 相似文献
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【目的】克隆Tri101并通过原核表达获得纯化蛋白,通过免疫SPF大白兔获得高效价、高灵敏度的多克隆抗体,为Tri101蛋白及转Tri101作物的检测提供抗体基础。【方法】以禾谷镰刀菌（Fusarium graminearium）F3210为材料,PCR法获得Tri101并连接至表达载体pET29a（+）,将重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）后利用IPTG进行诱导表达。利用纯化表达产物制备多克隆抗体。【结果】SDS-PAGE分析结果表明,Tri101在大肠杆菌BL21（DE3）中得到表达,重组蛋白大小为50 kD左右,以包涵体形式存在。利用HisTrap亲和柱纯化重组蛋白,最佳咪唑洗脱浓度为200 mmol•L-1。采用烟草蚀纹病毒蛋白酶切除重组蛋白中的His标签,酶切产物经HisTrap亲和柱再次纯化后免疫SPF大白兔,制备多克隆抗体。经ELISA法检测抗体效价为1﹕12 000,检测灵敏度为0.05×10-6 µg•mL-1。Western blotting结果证明制备的多克隆抗体对Tri101具有较好的专一性。【结论】通过Tri101的克隆及原核表达,获得了纯化的融合蛋白,通过免疫动物制备了兔源多克隆抗体,可用于Tri101蛋白及转Tri101小麦的检测。 相似文献
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根据已发表的Bm86基因序列,设计表达型引物,利用RT-PCR技术,从微小牛蜱饥饿幼蜱的研磨物中扩增Bm86基因,将PCR产物连入pGEM-T Easy载体,构建重组克隆载体pGEM-T easy-Bm86.测序分析表明:克隆的微小牛蜱Bm86基因序列与GenBank上登录的Bm86基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97%和95.6%.然后对重组克隆载体pGEM-T easy-Bm86进行双酶切,获得带有粘性末端的Bm86基因片段,并将此片段定向亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-Bm86,将其转化到BL21宿主菌中,用IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE检测表明表达产物为分子量为88 Ku的融合蛋白,目的蛋白约占蛋白总量的39%,表达量约为1.08 mg/mL.Western blot分析表明此表达产物能被兔抗微小牛蜱阳性血清所识别. 相似文献
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利用乳酸乳球菌nisin诱导基因表达系统(the Nisin Controlled gene Expression system,NICE)表达TK酶基因.采用基因克隆和表达方法,表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定.重组质粒测序结果表明,转化到乳酸乳球菌中的TK基因与pWSTK6基因(登录号为EU530625.1)相... 相似文献
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人乳铁蛋白基因乳腺特异性表达载体的构建及转染研究 总被引：5，自引：0，他引：5
构建了携带人乳铁蛋白(LTF)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因的乳腺特异性表达载体(pEBL),用脂质体法转染泌乳期莎能奶山羊乳腺上皮细胞,转染后于荧光显微镜下观察GFP表达情况。用G 418对转染细胞进行筛选,获得抗性细胞克隆,并对转染细胞进行PCR检测。结果显示,pEBL构建成功,转染6 h后可观察到细胞有GFP表达,PCR检测阳性克隆细胞转有LTF基因。表明pEBL载体已转染山羊乳腺上皮细胞,为进一步建立转基因动物乳腺生物反应器奠定了基础。 相似文献