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新城疫病毒F48E9株HN基因的克隆与酶切分析 总被引：9，自引：0，他引：9
为深入探讨新城疫病毒（ＮＤＶ）的结构与功能的关系，扩增和克隆了Ｆ４８Ｅ９株ＮＤＶ的ＨＮ基因。首先以提取的Ｆ４８Ｅ９株ＮＤＶ基因组ＲＮＡ为模板逆转录合成第一链ｃＤＮＡ，然后用ＨＮ基因特异性引物作ＰＣＲ扩增ＨＮｃＤＮＡ，结果得到１条分子量约１．８ｋｂ的ＤＮＡ带，与ＮＤＶＨＮ基因的大小一致。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交进一步证实其为ＨＮ特异性ｃＤＮＡ。随后采用平端连接法将其克隆到ｐＳＶ·Ｓｐｏｒｔｌ质粒中，应用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＳｃａⅠ、ＭｌｕⅠ、ＡｐａⅠ、ＰｓｔⅠ、和ＳｍａⅠ对ＮＤＶＦ４８Ｅ９株ＨＮｃＤＮＡ重组质粒作单酶或双酶切，结果表明，ＮＤＶＦ４８Ｅ９株ＨＮ基因较ＨｉｔｃｈｎｅｒＢ１株的ＨＮ基因缺少１个ＭｌｕⅠ位点（７０５ｂｐ左右），多１个ＰｓｔⅠ位点（８０２ｂｐ左右）。 相似文献
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新城疫病毒（ＮＤＶ）四平株、昌黎株、青岛株、Ｆ４８Ｅ８株分别接种９日龄ＳＰＦ鸡胚增殖，蚀斑纯化（３代），生物学特性鉴定及结合基因序列分析，表明ＮＤＶ四平株、昌黎株、青岛株均为强毒株。经差数、蔗糖密度梯度离心提纯病毒，分别提取ＲＮＡ，利用一对特异性引物及ＲＴ－ＰＣＲ方法，一次性扩增出 ＮＤＶ四平株、昌黎株、青岛株和 Ｆ４８Ｅ８株的全长 ＨＮ基因，分别将该ＨＮ基因克隆入载体ｐＫＳ（－）并进行测序。序列分析表明，这４个毒株ＨＮ基因核苷酸长度均为１７１３ｂｐ，编码５７１个氨基酸，其中四平株和 Ｆ４８Ｅ８株含有５个糖基化位点，青岛株和昌黎株含有 ６个糖基化位点，四平株含有 １２个半胱氨酸残基，而昌黎株、青岛株和Ｆ４８Ｅ８株含有１３个半胱氨酸残基。３个野生毒株与Ｆ４８Ｅ８相比较，核苷酸序列同源性为８５．７％－９９．３％，推导的氨基酸序列同源性为 ８９．５％－９８．８％，其中 ＮＤＶ四平株与标准强毒 Ｆ４８Ｅ８同源关系最近，核苷酸同源性为 ９９．３％，推导的氨基酸同源性为 ９８． ８％。 相似文献
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新城疫病毒F48E9株及东北地区流行株F基因遗传变异分析 总被引：16，自引：4，他引：12
采用异硫氰酸胍／酚／氯仿抽提一步法,提取新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４８Ｅ９株及２个东北地区分离株ＤＢ３、ＤＢ５基因组ＲＮＡ,并以其为模板经反转录合成Ｆ基因ｃＤＮＡ第１链,再利用ＰＣＲ技术分段增出Ｆ基因的ｃＤＮＡ。Ｆ４８Ｅ９、ＤＢ３和ＤＢ５株Ｆ基因的ｃＤＮＡ经酶切修饰后,插入ｐＵＣ１９的多克隆位点中,转化感受态Ｅ。ｃｄｉ ＤＨ５ａ,经相对分子质量比较、酶切分析及ＰＣＲ等鉴定方法筛选出Ｆ４８Ｅ９、ＤＢ３和 相似文献
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新城疫病毒F48E9株F基因主要功能区的核苷酸序列分析 总被引：12，自引：2，他引：10
本试验首先以ＮＤＶＦ４８Ｅ９株的基因组ＲＮＡ为模板,逆转录合成Ｆ基因ｃＤＮＡ第一链,再通过ＰＣＲ技术扩增Ｆ基因的ｃＤＮＡ,然后将其克隆到质粒ｐＵＣ１９中,经分子量比较、酶切分析、ＰＣＲ等方法证明,我们已经获得了ＮＤＶＦ４８Ｅ９株Ｆ基因的阳性克隆。经初步序列分析,ＦＡ段核苷酸序列与参考株（Ｄ２６／７６）序列同源性为８９％,ＦＢ段同源性为９１％。二者的氨基酸序列表明,Ｆ４８Ｅ９株Ｆ蛋白裂解位点与其它强毒株裂解位点氨基酸组成相同,即１１２ＲＲＱＲＲ１１６Ｆ１１７。这两段序列中包含的三个Ｃｙｓ残基和三个潜在的糖基化位点都相当保守。 相似文献
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新城疫病毒F48E8株血凝素—神经氨酸酶基因的克隆与鉴定 总被引：16，自引：1，他引：15
应用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）获取新城疫苗病毒Ｆ４８Ｅ８株的血凝素－神经氨酸酶基因。扩增反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析，长约１．９３ｋｂ与预期结果相符，将其克隆入质粒载体ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）中，经限制性内切酶分析和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实为新城疫病毒Ｆ４８Ｅ８株的血凝素－神经氨酸酶基因。 相似文献
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以鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）澳大利亚布里斯班分离株Ｒ９５的 ＲＮＡ为模板,运用的ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增其融合蛋白（Ｆ０）基因的ｃＤＮＡ。将扩增的Ｆ基因克隆到质粒ＰＵＣ１９中,转化入大肠杆菌ＪＭ１０９中,经ＡＩＸ平板筛选,ＰＣＲ等方法鉴定出Ｆ基因的阳性重组质粒,同时测定了Ｆ基因５’端７０９个核苷酸及３’端７６８个核苷酸的序列,对相应的氨基酸序列的研究表明,Ｂ９５株属弱毒株,含有Ｆ０中保守的疏水功能区和可糖基化位点,Ｂ９５与强毒株Ｆ４８Ｅ８株、Ｍｉｙａｄｅｒａ株和中等毒力的Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ Ｃ株的氨基酸序列的同源性在９０％左右。 相似文献
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新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因的分离克隆及在原核细胞中的表达 总被引：5，自引：1，他引：4
用ＳＰＦ鸡胚繁殖新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株（强毒）、ＬａＳｏｔａＥ４株（弱毒），对病毒进行纯化，抽提ＲＮＡ。用１对均为２７个碱基的引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，扩增出了２个毒株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因。将Ｆｃ基因定向克隆入ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ位点之间，获得２个毒株Ｆｃ基因克隆ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ，用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌⅠ双酶切法、ＰｓｔⅠ单酶切法、ＰＣＲ法和核酸探针法对其进行了鉴定。将鉴定好的ＬａＳｏｔａＥ４Ｆｃ基因定向导入表达载体质粒ｐＢＶ２２１，获得重组子ｐＢＶＬａＦｃ。ＰＣＲ和内切酶酶切法鉴定表明，Ｆｃ插入的位置和方向都正确无误。用Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α通过热诱导法进行了表达。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ法检测了表达产物。结果表明，有１条能够与ＮＤＶ多抗反应的特异条带，分子量约１５７００，与预期大小一致，说明是Ｆｃ基因的表达产物 相似文献
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ＮＤＶ北京强毒株Ｆ４８Ｅ９经ＳＰＦ鸡胚增殖 ,超速离心纯化 ,异硫氰酸胍法提取病毒ＲＮＡ后 ,用ＲＴ -ＰＣＲ扩增 ,得到其融合糖蛋白（Ｆ）基因。将扩增产物与ｐＧＥＭ -Ｔ载体相连接转化 ,经过Ａｍｐ -ＩＰＴＧ -Ｘｇａｌ（ＡＩＸ）平板筛选、ＨｉｎｄⅢ酶切及ＰＣＲ鉴定 ,初步获得了含Ｆ基因的阳性克隆。用渐近法对克隆片段进行全序列分析 ,证明得到了全长１７４４个核苷酸的ＮＤＶＦ蛋白基因。所获得Ｆ基因与国外已报道的６个强毒株序列进行比较 ,可知Ｆ４８Ｅ９与其它毒株均有一定差异（氨基酸差异在２６／５５３—４４／５５３） ,但… 相似文献
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根据NDVP蛋白己知基因序列设计合成了一对引物PU/PL ,利用RT_PCR扩增出了F4 8E9株P基因 12 72bp的片段 ,将该片段克隆到pMD18_TVector上 ,并对所得到的重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定 ,结果证明我们得到了这个基因片段的阳性重组子。为了更充分证实所得阳性质粒的可靠性 ,采用Sanger’s双脱氧末端终止法对阳性重组子从 5’端进行核苷酸序列测定 ,获得了F4 8E9株P基因片段 5’端的基因序列 ,利用DNASIS分析软件 ,将F4 8E9株与LaSota株的相应序列进行比较 ,其核苷酸序列同源性为 83 7%。至此 ,我们获得了F4 8E9株P基因的全长克隆 相似文献
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本实验根据已知新城疫病毒L基因序列分别设计了两对引物 ,引物 1(L1)、引物 2 (L2 )、引物 3(L3)、引物 4(L4)。以L1/L2为引物可以扩出 40 5 0bpF4 8E9株L基因的A片段 (LA) ,以L3/L4为引物可扩增出 35 0 4bpF4 8E9株L基因的B片段 (LB)。LA和LB 2个片段经特异性双酶切后用T4DNA连接酶连接成完整的F4 8E9株L基因并克隆到pMD18_T载体中 ,对克隆后L基因 5’端、3’端和连接点处的核苷酸序列进行了测定 ,经DNASIS软件分析表明为NDVL基因 ,证明我们获得了F4 8E9株L基因 相似文献
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构建新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)基因的原核表达载体,并将其在宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中表达。以NDV La Sota株NP基因序列为模板,设计特异性引物,通过PCR扩增获得NP蛋白全长基因片段,定向插入原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-NDV NP;将构建的重组质粒转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,表达出目的蛋白,并采用亲和层析的方法纯化表达蛋白;表达蛋白采用Western blotting方法检测其反应原性。结果显示,成功克隆了新城疫病毒NP基因全长,片段序列1470 bp;构建的pET-NDV NP载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误;转化表达宿主菌后经SDS-PAGE检测结果显示目的基因得到成功表达,且表达蛋白经Ni-NTA镍离子亲和层析法被成功纯化,蛋白质浓度为3 mg/mL;Western blotting检测结果显示表达蛋白具有良好的反应原性。试验结果表明,成功构建了含有新城疫病毒核衣壳蛋白基因的原核表达载体,成功表达、纯化得到了NDV NP蛋白。 相似文献
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新城疫病毒(长春株)F蛋白基因的克隆和序列分析 总被引：21，自引：6，他引：15
新城疫病毒（ＮＤＶ）长春株在鸡胚增殖后纯化,提取ＲＮＡ,然后利用特异性引物,经ＲＴ－ＰＣＲ一次性扩增出了ＮＤＶ长春株的全长Ｆ基因。将该Ｆ基因插入ｐＫＳ（－）后,进行了序列测定。序列分析表明,该Ｆ基因核苷酸长度为１７５８ｂｐ,编码５５３个氨基酸,序列中有６个糖基化位点,１３个半胱氨酸残基,裂解位点区（１１２～１１７）氨基酸序列为Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ,与所有弱毒株在这一区域的序列（Ｇｌｙ－Ａｒｇ／Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ／Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ）相符,证明长春株为弱毒株。同源性分析表明,长春株Ｆ基因与目前国外发表的其他ＮＤＶＦ基因相比,核苷酸序列同源性在８８％～９９％之间,推导的氨基酸序列同源性在９０％～９８％之间 相似文献
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以鹅副粘病毒HZ株的基因组RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增出F基因片段,然后将其克隆到pUCm-T载体中。经转化、筛选、酶切和PCR鉴定后,初步获得含鹅副粘病毒F基因的阳性克隆,并进行序列测定验证。结果表明,该基因由1 662个核苷酸组成,共编码553个氨基酸。与GenBank下载的9株参考毒株的F基因作同源性比较,发现HZ株与ZJ1、F48E9、Lasota等毒株的核苷酸同源性分别为98.3%、85.4%、82.7%;氨基酸同源性分别为97.8%、90.6%、88.1%。说明HZ株与经典的鸡新城疫病毒(NDV)在F基因上存在很大的差异,而与近年来的分离株亲缘关系较近。 相似文献
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新城疫病毒昌黎株与国外毒株HN蛋白基因核苷酸及氨基酸差异性分析 总被引：2，自引：1，他引：1
参考国外发表的新城疫病毒 ( NDV)的 HN基因序列设计了 1对特异性引物 ,应用 RT-PCR对 NDV昌黎株 (野毒 )的 HN基因进行了扩增 ,扩增产物克隆后测序。扩增出的 HN基因核苷酸长度为 1 74 2 bp,编码 571个氨基酸 ,序列中有 6个糖基化位点 ,1 3个半胱氨酸残基 ,与国外发表的强毒株序列相符。核苷酸同源性在 88.5%～ 92 .9%,推导的氨基酸序列同源性在 90 .0 %～ 94 .2 %之间。 相似文献