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1.
新城疫病毒F基因在大肠埃希菌中的表达及其抗原性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
构建新城疫病毒融合蛋白F基因的原核表达载体,并将其在宿主菌BL21(DE3)感受细胞中表达.以含有融合蛋白F基因的重组质粒pMD19T-F为模板,设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得F基因的F1片段,定向插入原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-F1,将构建成功的重组质粒pET-F1转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导,将其在宿主菌细胞中表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot方法检测.结果显示,成功克隆出了新城疫病毒F1基因片段序列852 bp.构建的pET-F1载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误,转化表达宿主菌后经SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,目的基因被成功表达,并具有良好的反应原性.成功构建了新城疫病毒的融合蛋白F基因原核表达载体,转化宿主细胞后成功表达了融合蛋白F1重组蛋白片段. 相似文献
3.
《中国兽医学报》2016,(3):384-388
构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)HuN4株GP5a蛋白基因的原核表达载体,并将其在宿主菌BL21(DE3)感受细胞中进行表达。以HP-PRRSV HuN4株GP5a蛋白的基因序列为模板,通过RT-PCR扩增获得GP5a蛋白全长基因片段,将其定向克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建含有GP5a蛋白基因的重组表达载体pGEX-GP5a;将构建的重组质粒转化宿主菌,经IPTG诱导,表达出目的蛋白;表达蛋白采用Western blot方法检测其反应原性。结果显示,成功克隆出了HP-PRRSV HuN4株GP5a蛋白基因全长,片段序列为156bp;构建的pGEX-GP5a载体经PCR、双酶切、测序鉴定均正确,转化表达宿主菌后经SDS-PAGE检测目的蛋白以包涵体的形式表达,用包涵体纯化法获得该蛋白;Western blot检测表达蛋白的反应原性,结果显示表达蛋白具有良好的反应原性。本试验成功构建了含有HP-PRRSV HuN4株GP5a蛋白基因的原核表达载体,成功表达、纯化得到了GP5a蛋白,为进一步研究GP5a蛋白的功能提供材料。 相似文献
4.
为分析新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)及其突变体(Fm)基因的反应原性,以携带有NDV-F和NDV-Fm基因的质粒为模板设计引物,PCR扩增产物经双酶切后分别连入原核表达载体pET-SUMO、pET-28a,构建重组质粒pET-SUMO-F、pET-28a-Fm,将重组质粒转化入宿主菌Rosetta 2感受态细胞,在IPTG诱导下表达。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,NDV-F和NDV-Fm在原核系统中表达后分别获得了相对分子量为64.7 kD和48.7 kD的重组蛋白;重组蛋白能被抗NDV鸡阳性血清识别。试验表明,NDV-F和NDV-Fm可以在原核系统中表达,且具有良好的反应原性。 相似文献
5.
试验旨在构建EfaA基因的原核表达质粒,并对其进行表达。根据GenBank中粪肠球菌EfaA基因序列(登录号:U03756)设计合成1对引物,利用PCR法扩增、克隆EfaA基因,并进行生物信息学分析,将EfaA基因亚克隆于pGEX-4T-1原核表达载体,构建pGEX-4T-EfaA原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达,筛选最佳诱导时间并分析其表达蛋白的生物学特征。结果发现,试验成功获得大小为873bp的粪肠球菌EfaA基因。经IPTG诱导后,获得分子质量约为59ku的EfaA重组蛋白,以37℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6h表达量最大。经Western blotting分析发现,具有较好的反应原性。本试验成功构建原核表达质粒pGEX-4T-EfaA,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达。 相似文献
6.
【目的】对华南地区分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)流行株NP蛋白进行原核表达,制备H9N2亚型AIV NP蛋白多克隆抗体。【方法】将1株H9N2亚型AIV的NP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建NP蛋白原核表达质粒。将重组质粒同时转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白。通过考马斯亮蓝染色和Western blotting分析并比较NP蛋白在两种表达菌中的表达量,进一步优化诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等条件,提高蛋白的表达效率。采用镍柱亲和层析法对NP蛋白进行纯化,用BCA法测定蛋白浓度。以纯化的NP蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光对所制备的多克隆抗体进行鉴定,通过间接ELISA测定抗体效价。【结果】试验成功构建pET-32a-H9N2-NP原核表达质粒并表达重组NP蛋白。考马斯亮蓝染色和Western blotting结果均表明,重组NP蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达水平远高于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,其大小约73 ku。诱导条件优化结果显示,重组NP蛋白在37 ℃、IPTG终浓度为1 mmol/L诱导7 h时的表达量最大,且通过镍柱纯化后得到纯度较高的重组蛋白。Western blotting和间接免疫荧光结果均表明,所制备的多克隆抗体能高效地与H9N2亚型AIV发生特异性结合。间接ELISA测得多克隆抗体的效价为1∶409 600。【结论】本研究制备的兔抗NP蛋白多克隆抗体效价较高,表明NP蛋白具有良好的免疫原性,为今后NP蛋白单克隆抗体的制备和ELISA检测方法的建立奠定了基础。 相似文献
7.
根据GenBank公布的羊布鲁氏菌(B.melitensis) M5-90株外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)基因序列,设计1对引物,以其全基因组为模板,采用PCR技术对其进行扩增,得到381 bp的目的片段,连接入pMD20-T载体,转化E.coli DH5α感受态细胞;测序正确后,构建pET-28a-Omp10原核表达质粒,再将该质粒转化入E.coli BL21(DE3), IPTG诱导表达融合蛋白His-Omp10,用SDS-PAGE和Western blotting进行分析.结果表明, 成功构建了含Omp10基因的原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了Omp10基因,诱导得到的融合蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明Omp10得到成功表达.该试验为布鲁氏菌病的进一步研究奠定基础. 相似文献
8.
为了成功克隆外膜蛋白16(outer membrane proteins 16, Omp16)基因并对其进行原核表达,试验根据GenBank中羊布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp16基因序列(登录号:JF918760.1)设计1对引物,从布鲁氏菌基因组中扩增出大小约为507 bp的目的基因片段,凝胶回收纯化目的片段,连接入pMD20-T质粒,转化E.coli DH5α并测序,测序正确后再亚克隆入pET-28a(+)表达载体,构建重组质粒pET-Omp16,转化入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导其表达,最后用Western blotting分析方法鉴定诱导得到的蛋白。结果表明,成功构建了pET-Omp16原核表达载体,并在E.coli BL21中表达了Omp16基因,诱导得到的蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明成功表达了目的基因。 相似文献
9.
《经济动物学报》2015,(3)
采用PCR技术扩增MEV VP2基因,将该基因片段定向克隆原核表达载体PET-30a,构建MEV VP2基因原核表达重组质粒PET-30a-VP2。将该重组质粒转化到宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导后进行SDSPAGE和Western-blotting分析。结果表明:该基因全长1 755 bp,其目的基因序列完全正确,能编码584个氨基酸。利用载体上的His标签对其进行纯化,经SDS-PAGE鉴定该重组蛋白以包涵体的形式存在,大小约为70 ku;Western-blotting验证该重组蛋白具有被抗MEV血清识别的特性,具有良好的反应原性,可为MEV基因工程亚单位疫苗、免疫学诊断方法等提供参考。 相似文献
10.
为了克隆羊传染性脓疱病毒CEV112基因并对其进行原核表达,根据GenBank中CEV112基因序列信息设计1对引物,以CEV基因组为模板,采用PCR扩增出1条大小为867bp的CEV112基因,将其连接到pMD20-T载体上,构建pMD20-T-CEV112重组质粒,转化到大肠埃希菌(E.coli)DH5α感受态细胞中,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建重组质粒pET28a-CEV112,转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果表明,成功构建了pET-28a-CEV112原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了CEV112基因,表达的融合蛋白大小约36ku,且主要以包涵体形式存在,为后续开展CEV112基因的功能研究奠定了基础。 相似文献
11.
研究猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的抗原性,为开发PCV2的检测方法奠定基础。以PCV2CAU0673毒株的DNA为模板,扩增获得702bp的目的片段,扩增产物克隆入pET30a(+)原核表达载体,构建pET30a-PCV2-ORF2重组质粒,转入大肠埃希菌BL21(DE3);在37℃以1mmol/L IPTG诱导表达6h;采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,并用不同浓度的尿素对纯化蛋白进行复性。SDSPAGE分析表明,该ORF2编码基因在大肠埃希菌中得到表达,蛋白大小约为34ku;Western blot检测结果表明,该重组Cap蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,与NA-PRRSV和PPV1血清不发生交叉反应。成功构建了PCV2-ORF2原核表达载体,实现了在大肠埃希菌中的表达,纯化后的复性蛋白具有较好的反应原性,为猪圆环病毒2型检测方法建立或试剂盒的开发奠定了基础。 相似文献
12.
鸡毒支原体黏附蛋白PvpA的原核表达与纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
利用基因重组技术将PvpA基因的PCR扩增产物与原核表达栽体pET-41a(+)连接,转化入DH5a感受态细胞,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入大肠杆菌BL21(D3)受体菌,用IPTG诱导蛋白表达.用纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备PvpA蛋白多克隆抗血清,并用Western blotting检验抗体特异性.结果表明,本研究成功获得PvpA纯化蛋白,在免疫印迹试验中,兔抗PvpA高免血清能与目的蛋白发生阳性反应,证实表达产物为特异性蛋白. 相似文献
13.
根据猪卵泡抑素(follistatin,FS)基因编码区序列(GenBank登录号:M36512.1)设计并合成1对引物,经PCR扩增获得了FS基因成熟肽序列,将其克隆入pMD18-T载体并转化E.coli DH5α感受态细胞,进行PCR、双酶切及测序验证。然后将其克隆到表达载体pRSET-A的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点之间,构建重组质粒pR-FS并转化E.coli BL21(DE3) 感受态细胞,再经PCR、双酶切和测序验证。转化重组质粒pR-FS的重组菌经IPTG诱导后的表达产物进行SDS-PAGE分析,分子质量与预期相符,为26.1 ku左右,经0.2 mmol/L IPTG诱导3 h之后表达量达到最高,约占总菌体蛋白的30%。表达产物可经Ni-NTA凝胶纯化。以上结果表明正确完成了猪FS基因成熟肽序列的克隆及其在大肠杆菌中的表达及纯化。 相似文献
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新孢子虫NcSRS2基因的亚克隆和表达 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究根据NcSRS2基因序列设计合成一对引物,将上、下游引物分别引入EcoRI,XhoI酶切位点,用PCR技术从pGEX-NcSRS2重组质粒扩增截去N端疏水氨基酸序列NcSRS2的基因片段（以下称dNcSRS2）,插入到pGEX-6p-1质粒的多克隆位点,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,于氨苄阳性LB培养平板上筛选阳性克隆,酶切及PCR鉴定;经IPTG诱导在E.coli中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并纯化.结果表明,新孢子虫dNcSRS2基因体外扩增产物与预期值相符,约1041bp;所构建pGEX-dNcSRS2重组质粒经双酶切与PCR鉴定,与预期结果一致;SDS-PAGE和免疫印迹显示,表达融合蛋白的分子量约为62.6 kD,表达效率为32.3%,该蛋白具有特异的免疫反应性,为新孢子虫病诊断试剂盒的研制和疫苗的研制奠定了基础. 相似文献
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依据GenBank中登录的坏死梭杆菌外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)基因序列,设计1对引物进行PCR扩增OMP片段并克隆至pET-28a中,构建原核表达重组质粒pET-28a-OMP。将pET-28a-OMP转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,表达含2个His的重组蛋白。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,该重组蛋白分子质量为93 ku,为包涵体表达,具有反应原性。本试验结果为坏死梭杆菌OMP免疫机制的研究提供了基础数据。 相似文献
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将禽白血病病毒p27基因克隆并构建重组表达质粒pET28a-p27,在大肠杆菌BL21中经IP TG诱导后产生可溶性表达蛋白。表达的蛋白用Western blot进行活性检测,其能与辣根过氧化物酶标记的兔抗p27抗体发生特异性反应;采用金属螯和层析对表达蛋白进行纯化,其纯度约为95％;用纯化的表达蛋白p27免疫家兔制备抗血清,ELISA抗体效价可达1∶25600。研究结果表明,大肠杆菌表达的p27蛋白具有良好的抗原性,可以替代纯化病毒蛋白用于禽白血病病毒检测。 相似文献
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马尔堡病毒核蛋白的原核表达及纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
目的以原核表达的方式获得了马尔堡病毒的核蛋白,并纯化。方法将马尔堡病毒核蛋白基因亚克隆到原核表达质粒pET-28(a)中,构建重组表达质粒pET-28(a)-M-NP,并将重组质粒用热休克方法转化BL21(DE3)感受态细菌,用IPTG诱导蛋白表达后,以SDS-PAGE分析表达形式及表达量,并利用His-Band Ni+柱纯化。结果成功构建重组表达质粒pET-28(a)-M-NP,以1.0mmol/L终浓度的IPTG在37℃诱导表达5h后,破菌沉淀中有目的蛋白表达。结论成功表达并纯化了马尔堡病毒的核蛋白,为后续研究奠定了基础。 相似文献
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