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1.
《中国兽医学报》2019,(2):260-264
为提高布鲁菌疫苗株的免疫保护效果,本试验以牛布鲁菌疫苗株S19为研究对象,将羊布鲁菌Omp31基因克隆、扩增并插入至广宿主质粒pBBR1MCS-2中,构建重组质粒pBBR1MCS-Omp31;通过电转化的方式转入S19感受态细胞中,经抗性基因筛选和PCR验证,获得重组牛布鲁菌S19-Omp31株;该重组菌株连续传25代未发现重组质粒和Omp31基因丢失,表明其遗传稳定性良好;进一步经SDS-PAGE检测可见约26 000相对分子质量的目的条带,采用Western blot法检测显示目的蛋白可与His单克隆抗体及Omp31蛋白高免血清反应。本研究构建的重组牛布鲁菌S19-Omp31株能够稳定表达目的基因,为进一步开展S19-Omp31株的免疫效果评价奠定基础。 相似文献
2.
通过等位基因交换,分别敲除牛流产型布鲁菌减毒活疫苗S19株和缺失株S19-Δbp26的znuA基因,构建了布鲁菌znuA基因单缺失株S19-ΔznuA和bp26、znuA基因双缺失株S19-Δbp26-ΔznuA,对获得的2种缺失株进行形态学、生长特性、稳定性和基因测序验证。结果表明,S19株和S19-Δbp26株的znuA基因均成功缺失,生长特性表示2种缺失株与亲本株生长基本无差异;体外连续传至20代,菌落PCR鉴定及基因测序结果显示2种缺失株均遗传稳定。牛流产型布鲁菌单缺失株S19-ΔznuA和双缺失株S19-ΔznuA-Δbp26的成功构建为布鲁菌新型疫苗的研发、布鲁菌感染动物过程中ZnuA蛋白的作用机理及其与Bp26蛋白之间关系的研究奠定了基础。 相似文献
3.
桑螟(Glyphodes pyloalis)是蚕区桑园的主要害虫之一,鉴定其抵御各种环境胁迫相关的基因,是制定防治新策略的重要理论依据。对桑螟幼虫转录组数据的分析中,发现桑螟胞外铜锌超氧化物歧化酶(ec Cu/Zn SOD)基因在应对高温胁迫时的表达量发生显著变化。为了明确ec Cu/Zn SOD在桑螟应对不良环境中发挥的作用,克隆和鉴定了其编码基因Gpec Cu/Zn SOD(Gen Bank登录号:MG566057)。Gpec Cu/Zn SOD基因的开放阅读框长726 bp,编码241个氨基酸,编码蛋白质序列与脐橙螟(Amyelois transitella)的一种SOD蛋白基因(Gen Bank登录号:XP_013197347.1)编码氨基酸序列的一致性高达83%。采用邻近相接法构建桑螟与其他昆虫的Cu/Zn SOD系统发生树,结果显示Cu/Zn SOD被分为ec Cu/Zn SOD和ic Cu/Zn SOD两类,主要是随物种进化而进化。采用半定量RT-PCR检测不同温度处理桑螟5龄幼虫的Gpec Cu/Zn SOD基因表达情况,结果显示幼虫体内的Gpec Cu/Zn SOD在高温(40℃)和低温(4℃)条件下表达量最高。构建p Cold-Gpec Cu/Zn SOD重组表达质粒,并在大肠埃希菌中实现异源表达。利用镍柱亲和层析法分离纯化重组Gpec Cu/Zn SOD蛋白,采用WST-1法测定重组Gpec Cu/Zn SOD蛋白在40℃时的酶活性最高,并且经60~70℃处理后仍然具有较高的酶活性。采用牛津杯法分析重组Gpec Cu/Zn SOD的抗氧化活性表明:过表达Gpec Cu/Zn SOD的大肠埃希菌抗氧化的能力显著增强,显示Gpec Cu/Zn SOD具有较强的抗氧化功能。研究结果暗示Gpec Cu/Zn SOD在桑螟应对高温胁迫过程中发挥着重要作用。 相似文献
4.
对羊布鲁菌(Brucella)陕西分离株OMP19基因进行克隆、序列分析及原核表达。利用GenBank中收录的布鲁菌(KT229642.1)OMP19基因序列,设计合成引物,应用PCR技术扩增OMP19基因,并将OMP19基因连接到原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET28a-OMP19,转化到BL21感受态细胞进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot法分析。结果克隆了羊布鲁菌陕西分离株OMP19全基因序列,核苷酸序列分析表明,陕西分离株OMP19基因与国内外已报道的羊布鲁菌核苷酸同源性超过98%,氨基酸同源性超过98%。OMP19重组菌经诱导表达约为19ku的重组蛋白,该蛋白能与本实验室鉴定保存的阳性血清特异性结合,反应原性良好。为羊布鲁菌陕西分离株分子生物学特性研究提供资料,为进一步进行基因工程疫苗研制及ELISA试剂盒抗体检测提供了基础。 相似文献
5.
为建立区分猪种布鲁菌S2疫苗株接种奶牛与布鲁菌自然感染奶牛,BLAST比对分析羊种、牛种、猪种、犬种、沙林鼠种和绵羊种6种布鲁菌基因序列,发现repA-related基因是猪种布鲁菌与牛种及羊种布鲁菌的差异基因。设计引物PCR扩增获得repA-related基因片段,克隆并原核表达得到了布鲁菌repA-related融合蛋白,以repA-related蛋白建立间接ELISA检测方法。用repA-related蛋白间接ELISA检测猪种S2疫苗株接种动物血清为阳性,检测牛种和羊种布鲁菌自然感染动物血清为阴性。repA-related蛋白间接ELISA能从试管凝聚实验(SAT)及常规ELISA检测阳性的奶牛血清样本中,区分出S2疫苗接种牛与牛种布鲁菌感染牛。 相似文献
6.
《中国预防兽医学报》2015,(11)
通过分析布鲁菌疫苗株基因序列遗传变异情况,为疫苗的免疫保护力的评价提供理论依据,本研究利用高变量八聚物寡核苷酸指纹技术(HOOF-Prints)对国内主要布鲁菌疫苗-羊种布鲁菌疫苗M5、猪种布鲁菌疫苗S2、牛种布鲁菌疫苗S19、人用布鲁菌疫苗104M进行序列分析,并基于布鲁菌标准参考株采用软件DNAMAN进行系统进化树分析。结果表明4种疫苗株的基因序列均发生了变异,但系统进化树分析显示这些疫苗株与对应的参考株遗传关系仍然最近,同时表明该指纹技术在分子水平上可以用于分析和了解国内主要疫苗的变异情况,为疫苗的免疫效果提供理论依据。 相似文献
7.
为建立区分猪种布鲁菌S2疫苗株接种奶牛与布鲁菌自然感染奶牛,BLAST比对分析羊种、牛种、猪种、犬种、沙林鼠种和绵羊种6种布鲁菌基因序列,发现repA—related基因是猪种布鲁菌与牛种及羊种布鲁菌的差异基因。设计引物PCR扩增获得repA-related基因片段,克隆并原核表达得到了布鲁菌repA—related融合蛋白,以repArelated蛋白建立间接EI．IsA检测方法。用repA—related蛋白间接ELISA检测猪种s2疫苗株接种动物血清为阳性,检测牛种和羊种布鲁菌自然感染动物血清为阴性。repA—related蛋白间接EusA能从试管凝聚实验（SAT）及常规ELIsA检测阳性的奶牛血清样本中,区分出s2疫苗接种牛与牛种布鲁菌感染牛。 相似文献
8.
《畜牧与饲料科学》2017,(10)
[目的]为研究热激蛋白在布鲁菌酸压力条件下发挥的作用,对其编码基因之一的BMEⅡ0042基因在酸压力条件下的表达情况进行检测。[方法]提取正常培养条件下及酸性培养条件下布鲁菌16M株总RNA,先将其反转录为cDNA,再利用荧光定量PCR技术(RT-qPCR)检测布鲁菌热激蛋白编码基因BMEⅡ0042在酸压力下的表达情况。[结果]在酸性条件下,布鲁菌BMEⅡ0042基因相对表达量为16S rDNA的6.20倍,表明该基因表达上调。[结论]布鲁菌热激蛋白编码基因BMEⅡ0042在酸压力条件下上调表达,为进一步研究热激蛋白在布鲁菌酸调控网络中发挥的作用奠定了基础。 相似文献
9.
为了获得高效表达且抗原性好的布鲁氏杆菌S2弱毒疫苗特异性基因重组抗原,研究从S2疫苗全基因组中筛选出特有基因S2JY1,并从S2疫苗株基因组DNA中扩增出S2JY1基因片段,用生物信息学方法对S2JY1基因编码的蛋白进行了理化性质、二级结构、信号肽等分析;对扩增的S2JY1基因进行了克隆测序;构建了原核表达载体pET-30a-S2JY1并转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,诱导表达后进行Western-blot免疫印迹试验。结果表明:S2JY1基因编码145个氨基酸,理论PI值为5.55,不稳定系数为25.51;跨膜结构和信号肽分析显示该蛋白为无跨膜区且无信号肽的外膜蛋白;亲疏水性分析表明该蛋白为亲水性蛋白。构建的S2JY1基因原核表达载体可在大肠杆菌中重组表达;S2JY1基因重组蛋白能够与布鲁氏杆菌S2疫苗免疫的羊血清发生特异性结合反应,不与自然感染羊血清反应。说明S2JY1基因原核表达载体具有较好的抗原性和特异性,可用于布鲁氏杆菌病鉴别诊断研究。 相似文献
10.
现有的布鲁菌减毒活疫苗存在一定毒力,且野强毒株和减毒活疫苗株间缺少可供鉴别的抗原,导致在血清学检测上自然感染与疫苗接种很难区分,限制了现有的减毒活疫苗的广泛应用.本文拟对布鲁菌的减毒活疫苗株S2进行遗传改造,克服上述缺陷.本研究利用同源重组的方法,得到了布鲁菌S2株omp10基因缺失株.分别用基因缺失株和疫苗株感染小鼠,比较基因缺失株小鼠体内的存活能力.结果成功构建了布鲁菌S2株omp10基因缺失株,动物试验结果表明,基因缺失株仍能在小鼠体内存活,具备作为减毒活疫苗的特性.与原始S2株比较,基因缺失株的感染力进一步减弱.表明omp10基因在布鲁菌的毒力及体内生存方面发挥了作用,为基因标记疫苗的研制奠定了基础. 相似文献
11.
利用CRISPR/Cas9系统构建敲除Prdx6基因的RAW264.7小鼠巨噬细胞系,为探讨Prdx6与布鲁菌感染及胞内寄生的关系构建细胞模型。针对Prdx6基因的第1外显子设计sgRNA,构建重组表达载体Prdx6-pX459-sgRNA,将重组质粒转染RAW264.7细胞,嘌呤霉素初步筛选。单细胞接种并扩繁,提取基因组DNA,PCR及测序鉴定。结果表明,在敲除细胞株基因组中存在碱基缺失,导致移码突变。说明成功获得敲除Prdx6基因的RAW264.7细胞系。 相似文献
12.
利用激光共聚焦显微镜和实时荧光定量PCR等技术,探究旋毛虫成虫排泄分泌物(核酸酶抑制剂ATA阻断DNase酶活性条件下)对中性粒细胞胞外诱捕网形成、活性氧生成和细胞因子产生的影响。结果显示,旋毛虫成虫排泄分泌物能够抑制中性粒细胞胞外诱捕网的形成,减少活性氧生成,促进细胞因子IL-1β、IL-10和TNF-α的表达,降低IL-4的表达,对IFN-γ表达水平无明显影响。结果表明,旋毛虫排泄分泌物能够影响中性粒细胞的功能,为进一步研究旋毛虫免疫逃避机制等奠定良好基础。 相似文献
13.
应用制备的牛病毒性腹泻病毒(BVDV) CC13B毒株E2蛋白的单克隆抗体与多克隆抗体,建立了基于单抗捕获牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus,BVD-MDV)抗原的双抗体夹心ELISA方法。方阵试验确定的捕获BVDV抗原的单克隆抗体最佳抗体包被量为200 ng/孔,酶标多克隆抗体的最佳稀释浓度为1 000倍稀释。对100份BVDV阴性粪便样品进行检测与统计学处理,确定了夹心ELISA检测BVDV抗原的判定标准为待检样品D490值≥0.156 7时,检测结果判定为阳性。特异性、敏感性和重复性试验结果显示,建立的检测BVDV抗原的方法具有特异、敏感、快速及重复性好等特点。以建立的单抗捕获BVDV抗原的夹心ELISA方法,调查了山东、河南和吉林3省部分地区牛群BVDV感染情况,发现上述地区牛群的BVDV感染率低至6%。本研究结果为BVDV感染的诊断、检疫、净化及防制提供了有效的技术手段及流行病学理论依据。 相似文献
14.
本试验在野鸟禽流感病毒紧急疫情检测过程中鉴定并分离到1株H5N8高致病性禽流感病毒,利用病毒全基因组测序、系统发育及关键氨基酸位点分析解析了该野鸟源H5N8禽流感病毒分离株遗传进化情况,通过体外复制动力学试验及小鼠感染试验,评价了该野鸟源H5N8禽流感病毒分离株对哺乳动物致病性。进化分析显示,该病毒株属于Clade 2.3.4.4,可以不经适应直接感染小鼠并在呼吸系统内复制,表现出有限的组织嗜性,对小鼠呈低致病性。其在体内外复制能力较低。结果表明,本试验加深了对野生鸟携带H5N8禽流感病毒的认识和理解、对野鸟源H5N8禽流感病毒生物学特性的评价,为预测野鸟源H5N8禽流感病毒遗传进化趋势及其生物安全风险评估提供借鉴和参考。 相似文献
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新城疫病毒样颗粒已开发成一种高效递送外源蛋白的载体平台。本研究在小鼠模型中开展了嵌合布鲁菌BCSP31病毒样颗粒(BCSP31-cVLPs)免疫原性及其保护效力评价。体内试验数据表明,BCSP31-cVLPs能有效激活脾脏中树突状细胞,进而促进初始型CD3^+CD4^+ T的活化。ELISA法检测小鼠血清结果表明,BCSP31-cVLPs可刺激机体产生针对重组BCSP31蛋白的特异性抗体水平,且呈剂量依赖性。流式细胞术检测结果显示,BCSP31-cVLPs可激活T细胞并使其分化。攻毒结果表明,BCSP31-cVLPs具有与疫苗株M5相当的免疫保护效力。本研究为新型布鲁菌疫苗的研制提供了数据支撑,并扩展了新城疫病毒样颗粒疫苗载体平台的应用。 相似文献
16.
华支睾吸虫病是由华支睾吸虫引起的危害严重的鱼源性人兽共患寄生虫病,主要引起人和多种动物的肝胆病变,严重者可引起胆管上皮癌,因此华支睾吸虫被国际癌症署(IARC)归为第Ⅰ类生物性致癌因子。我国华支睾吸虫病主要流行于淡水资源丰富的地区,在我国27个省、市、自治区均有该病人体感染的报道。近年来,我国华支睾吸虫感染率呈上升趋势,且受威胁地区和人数不断增加。对该病的诊断和防控已刻不容缓,传统的病原学诊断方法存在着一定的局限性和弊端。免疫学方法和分子生物学技术的不断发展为该病的诊断提供了新的途径,今后在华支睾吸虫病的基础研究与防控中起到更加重要的作用。论文就华支睾吸虫病的流行特点及诊断方法研究进展进行综述,以期为华支睾吸虫病的研究提供参考。 相似文献
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为构建表达鸡新城疫病毒(NDV)HN和传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2融合蛋白的重组减毒沙门菌,并分析其生物学特性。本研究扩增了NDVHN和IBDVVP2主要抗原基因片段,通过重叠延伸PCR扩增获得HN-VP2融合基因,构建重组质粒pYA-HN-VP2,将该重组质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔcyaΔasd中,获得表达HN-VP2融合蛋白的减毒重组菌SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA-HN-VP2),并分析其生化特性、遗传稳定性和毒力等生物学特性。Westernblot结果显示,重组减毒沙门菌可分泌表达HN-VP2融合蛋白,大小为84ku,且该融合蛋白分别能与相应特异性阳性血清发生反应;生物学特性结果显示,重组菌株失去了利用麦芽糖、山梨醇及乳糖等碳源的能力,其生长速度显著慢于野生菌株SL1344;毒力较野生菌株至少下降5个对数单位,且能够稳定遗传重组质粒pYA-HN-VP2。本研究为鸡新城疫-传染性法氏囊病-沙门菌病的三联口服疫苗研制奠定重要基础。 相似文献
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为了建立一种快速、特异、敏感的检测牛支原体血清抗体的方法,对牛支原体(M.bovis)P48膜蛋白基因进行密码子优化,并在编码基因两端加入酶切位点。利用生物学软件对P48蛋白进行抗原位点和亲水性分析,选择P48蛋白的主要抗原表位区和亲水性区域以及全基因进行原核表达。采用SDS-PAGE和Western blot对重组蛋白进行鉴定及反应原性分析。结果显示,表达的P48全蛋白、28～185、221～455位氨基酸区域蛋白均能与牛支原体阳性血清发生特异性反应,P48(221～455)效果最好。采用Ni-NTA对目的蛋白进行纯化,并基于纯化的P48(221～455)蛋白建立了一种间接ELISA检测方法。该方法组内及组间变异系数均小于7%,重复性较好。临床样本检测结果表明,建立的检测方法符合率较高。 相似文献