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1.
将猪肺炎支原体168株全菌蛋白免疫小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,3次亚克隆后,获得了4株针对168株全菌蛋白的单抗,分别将其命名为2F5、2G7、4F5、5E9。Western-blot检测结果表明,2G7、4F5与猪肺炎支原体具有特异性反应条带,不与猪鼻支原体、大肠杆菌反应。亚型鉴定结果表明,两株特异性单抗(2G7、4F5)的亚型属IgG1,轻链为κ型,2F5、5E9亚型属IgG2a,轻链为κ型。间接免疫荧光结果表明,4株单抗均与猪肺炎支原体168株有特异性荧光反应,特异性单抗的获得为猪肺炎支原体的检测及机理研究奠定基础。 相似文献
2.
检测猪肺炎支原体抗体间接ELISA方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
选用猪肺炎支原体Mhp J株培养物制备抗原,建立检测猪肺炎支原体抗体的间接ELISA(酶联免疫吸附)方法.结果显示,ELISA试验的最佳反应条件为:抗原包被浓度为1.5 μg/ml,待检血清的最佳稀释浓度1∶100,2%明胶作封闭液,抗原抗体最佳结合时间为90 min,酶标抗体1∶10 000(体积比)稀释,最佳作用时间为60 min.对136份样品检测结果表明,建立的猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测方法与美国IDEXX公司生产的猪肺炎支原体抗体检测试剂盒检测的符合率达到83.8%,假阴性率8.8%,假阳性率1.5%. 相似文献
3.
猪肺炎支原体P46蛋白单克隆抗体制备 总被引：2，自引：0，他引：2
P46蛋白是猪肺炎支原体的主要免疫优势蛋白,且与其他支原体无交叉反应,常作为猪肺炎支原体检测的靶蛋白。制备针对该蛋白的特异性单抗能为猪肺炎支原体的检测及机理研究提供有效的资源。本研究取猪肺炎支原体全菌抗原免疫小鼠,用大肠杆菌表达的P46蛋白作为筛选抗原制备了2株特异性单克隆抗体1A4和3C11。结果显示,2株单抗ELISA效价最高可达1∶64 000。Western-blot结果表明,2株单抗均能与原核表达的P46蛋白及猪肺炎支原体全菌蛋白中46 000大小的蛋白发生特异性反应;2株杂交瘤细胞株经3个月冻存或连续传代3个月均能保持较高的滴度。本研究成功制备了2株针对猪肺炎支原体P46蛋白的特异、稳定且高滴度的单克隆抗体。 相似文献
4.
[目的]研究猪肺炎支原体P97R1基因在毕赤酵母中的分泌表达及初步应用。[方法]根据Genbank中猪肺炎支原体P97R1基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增出猪肺炎支原体特异性蛋白P97R1基因,克隆入酵母表达载体pPICZα-A,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-P97R1;PICZα-A-P97R1经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株GS115;将PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导分泌P97R1蛋白于发酵上清液中,并通过SDS-PAGE电泳以及Western-blotting对其进行鉴定。[结果]P97R1蛋白基因获得了分泌性表达,表达量达499μg/ml,而且具有良好的反应原性;同时用表达蛋白经过各项优化建立了猪肺炎支原体间接ELISA检测方法,经检测该方法具有良好的特异性和重复性。[结论]该研究为猪肺炎支原体免疫检测试剂盒和基因工程疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
5.
制备新城疫病毒(NDV)NP蛋白单抗,以期为NDV抗原表位研究及检测方法建立方面奠定基础。利用NDV F48E9株pET32a-NP重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,间接ELISA筛选,获得了2株稳定分泌抗NP重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G3、4B12。经间接ELISA测定,腹水抗体效价分别为1 2.56×105、1 5.12×105。亚类鉴定结果表明这两株单抗均为IgG1。Western blot分析结果显示,1G3、4B12均能特异性识别重组NP蛋白。与NDV感染细胞经间接免疫荧光试验检测均呈黄绿色荧光。经相加ELISA测定表明两株单抗识别的抗原表位不同。 相似文献
6.
猪肺炎支原体(Mhp)是猪气喘病的主要病原体。利用Mhp NJ株的DnaK基因通过SOE-PC(splicing withoverlap extension PCR)R扩增和突变,获得了目的片段并插入表达载体pET-28a(+)中,然后转入宿主菌BL21(DE3)。重组质粒经1 mmol/L IPTG在37°C温度下诱导5 h,目的蛋白可达到总蛋白的14.1%。Western Blotting证明表达的重组蛋白具有猪肺炎支原体反应原性,用该重组蛋白建立的ELISA方法可检测到猪肺炎支原体抗体。此为该病基因工程疫苗抗原的筛选和ELISA诊断试剂盒的研制奠定基础。 相似文献
7.
采用改进的碳二亚胺法,将半抗原二氟沙星(DIF)与载体牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联,制备得到二氟沙星全抗原DIF-BSA和DIF-OVA.采用紫外(UV),凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定;用BSA-DIF免疫BALB/C小鼠,间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠;应用杂交瘤技术制备二氟沙星单克隆抗体(DIF mAB),并对其效价、亲和力和特异性等进行鉴定.结果表明,BSA与DIF偶联成功,分子结合比为1:4.7,筛选出1H10、2F12、4D8共3株敏感特异的杂交瘤细胞,间接ELISA效价细胞培养上清分别为1:5.12×102、1:3.2x101、1:2.56×102,腹水效价分别为1:2.56×105、1:1.28x105、1:6.4×104.同种亚型分别为IgG1、IgG1、IgG2a,亲和常数(Ka)分别为2.94×1010L/mol、1.72×1010L/mol和1.35×1010L/mol.亲和力最高的1H10对DIF的IC50为2.2ng/ml,单抗与其他氟喹诺酮类药物和磺胺类药物无交叉反应.通过试验获得高效价、敏感、特异的mAb,适用于动物性食品中DIF的残留检测的免疫学试验. 相似文献
8.
Zhang@yahoo.com.cn。 《勤云标准版测试》2006,(5)
将氯霉素(CAP)中的羟基(-OH)与琥珀酸酐反应引入活性基团羧基形成具有半抗原结构特征的氯霉素半琥珀酸酯(CAP-HS);采用混合酸酐(MA)法将CAP-HS与BSA和OVA偶联合成人工免疫原BSA-CAP-HS和包被抗原OVA-CAP-HS,采用红外(IR)、紫外(UV)、凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定;用BSA-CAP-HS免疫BALB/C小鼠,间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠;应用杂交瘤技术制备氯霉素单克隆抗体(CAPmAb),并对其效价、亲和性和特异性等进行鉴定。结果表明,BSA与CAP-HS偶联成功,分子结合比为1∶15.6;筛选出1A10、2B5、4F9共3株敏感特异的杂交瘤细胞,间接ELISA效价细胞培养上清分别为1∶6.4×102、1∶3.2×102、1∶1.28×103,腹水分别为1∶1.6×105、1∶8×104、1∶6.4×105,同种型分别为IgG1/κ、IgG2a/λ、IgG2a/κ,亲和常数(Ka)分别为2.14×108、1.68×109、1.84×1010(L/mol);亲和力最高的4F9株对CAP的IC50为7.54ng/ml,经WestGold鉴定与CAP特异性结合,与氯霉素琥珀酸钠的交叉反应分别为150%,与其它CAP类药物和抗菌素无交叉反应性。通过试验获得了抗CAP高价、敏感、特异的mAb,可用于CAP残留检测的免疫学试验。 相似文献
9.
抗伪狂犬病毒Ea株单克隆抗体的制备及鉴定 总被引：3，自引：0，他引：3
将伪狂犬病毒Ea株纯化后免疫雌性Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/O的骨髓瘤细胞融合,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)进行筛选,获得了2株抗PRV的单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为3G7E3和4A6F5,其细胞培养上清及小鼠腹水效价(ELISA)分别为1:212、1:212及1:100×212、1:100×212。特异性试验和免疫荧光结果显示,3G7E3和4A6F5仅与PRV反应,而与PPV、PRRSV、JEV和HCV等病毒不发生交叉反应;用单抗建立的夹心ELISA试验能检出伪狂犬病毒。表明本研究所获得的2株单抗是PRV特异性的。这2株分泌抗PRV单抗的杂交瘤细胞株的获得为进一步建立准确快速的抗原检测方法奠定了基础。 相似文献
10.
运用杂交瘤细胞技术,以牛型结核分支杆菌免疫Balb/c小鼠,用其超声波裂解液筛选杂交瘤细胞,得到了2株能稳定分泌抗牛型结核杆菌抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5D4和4C3,并对它们的特性作了初步鉴定.经鉴定,2株单克隆抗体均为IgG1亚类.腹水经ELISA检测,效价可达1∶1×104~1∶1×105,同时分析了2株单抗的抗原位点,结果表明2株单抗针对不同的抗原位点.单抗的特异性试验结果显示,2株单抗与大肠杆菌,沙门氏菌,金黄色葡萄球菌等均没有反应,但都与人型结核分支杆菌有不同程度的交叉反应.并应用免疫胶体金技术制备牛结核杆菌胶体金快速诊断试纸条做应用性鉴定.该试纸条只与结核杆菌发生反应,而不与沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、李氏杆菌等发生交叉反应.该试纸条最低能检测出浓度为1×106个/mL的牛结核杆菌菌液,有较高的灵敏度. 相似文献
11.
单克隆抗体夹心ELISA试验检测鸡新城疫病毒抗原的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
从10株抗鸡新城疫病毒(NDV)特异性单克隆抗体(MAbs) 中筛选出2株MAbs—M22和F23,分别用作包被抗体和酶标抗体而建立的MAbs—夹心ELISA试验,对提纯NDV的最小检出量为25ng/ml病毒蛋白.NDV鸡阳性血清对本试验的特异性阻断作用和与其他禽类病毒交叉反应的阴性结果,证明本试验对NDV的特异性。从临床疑为鸡新城疫的724只病鸡的口腔棉试样品中共检出阳性502只,其中200个样品与病毒分离试验结果完全一致,两者均查出阳性鸡176只。 相似文献
12.
P65蛋白是猪肺炎支原体的主要免疫优势蛋白,与其他支原体无交叉反应,常作为猪肺炎支原体检测的靶蛋白。本实验应用原核表达的重组 P65蛋白免疫小鼠,用 Mhp全菌蛋白和P65蛋白筛选,制备了1株特异性单克隆抗体3G12。鉴定结果表明,该株单克隆抗体可与 P65蛋白和 Mhp全菌蛋白反应,采用间接 ELISA法测得3G12细胞培养上清与P65蛋白反应抗体的效价为1∶12800,与全菌蛋白反应抗体的效价为1∶3200;3G12腹水与P65蛋白反应的抗体效价为1∶4000000以上,与168全菌蛋白反应的抗体效价为1∶20000以上,细胞经长期体外培养和冻存后复苏能稳定分泌抗体。本研究成功获得到1株针对 P65和Mhp全菌的单克隆抗体,为猪肺炎支原体致病机制和检测方法的进一步研究提供了基础。 相似文献
13.
复合免疫制备3种有机磷农药单克隆抗体的技术研究 总被引：4，自引：1，他引：3
以α-氨基丁酸和农药中间体为原料合成了甲基对硫磷、杀螟硫磷和甲基毒死蜱3种有机磷农药人工半抗原(H1、H2和H3);通过活泼酯法将H1、H2和H3分别交联于牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)上制备免疫原和包被原.以等体积混合的 H1-BSA、H2-BSA和H3-BSA复合免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备单克隆抗体获4株抗上述复合抗原的单克隆抗体,其中甲基对硫磷1株(H9/A3),杀螟硫磷2株(H9/B3、C8/H6),甲基毒死蜱1株(G7/F5).所获4株抗体的类型及亚类均为IgG1,轻链均为κ链,间接ELISA法测定腹水效价均高达1×106.间接竞争ELISA法测定H9/A3、C8/H6和G7/F5细胞株的抑制中浓度(I50)分别为1070、404和752 μg·L-1,且与类似物无交叉反应.本研究建立了一种可在较短的研制周期内,通过单次细胞融合获得多种不同农药的单克隆抗体的有效方法. 相似文献
14.
应用杂交瘤技术制备了4株稳定分泌抗仿刺参Apostichopus japonicus体腔细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对其单克隆抗体的特性进行了分析。结果表明：单抗1C7和1H7主要结合淋巴样细胞,单抗2E8可与所有体腔细胞结合,单抗4E9主要结合球形细胞;单抗2E8、4E9与仿刺参体腔液具有明显的交叉反应,单抗1C7和1H7则与体腔液无交叉反应;单抗1C7和4E9属于IgG1,2E8属于IgG2a,1H7属于IgM亚型;单抗1C7和1H7均可识别相对分子质量为37 000的蛋白,单抗2E8可同时识别相对分子质量为37 000和61 000两种蛋白,单抗4E9可识别相对分子质量为108 000的蛋白。该单抗的制备为进一步研究仿刺参体腔细胞和体腔液之间的关系,体腔细胞的分类、分布、发生、分化及功能提供了新的工具。 相似文献
15.
牛乳铁蛋白直接竞争ELISA检测法的建立 总被引：3，自引：0，他引：3
[目的]建立一种检测牛乳铁蛋白(LF)含量的竞争ELISA检测方法。[方法]制备鼠抗牛LF单克隆抗体,采用直接竞争ELISA测定酶标记物效价,建立牛LF的直接竞争ELISA检测方法。[结果]纯化后,制备的鼠抗牛LF单抗效价达1∶1 280 000,且鉴定为IgG1。该单抗对牛乳铁蛋白具有很强的特异性。制备酶标单抗的效价为1∶640 000。抗原包被物和酶标单抗的最适工作浓度分别为1.0μg/ml和1∶40 000。抗原用碳酸盐缓冲液(pH值为9.6)包被先在4℃过夜、再37℃放置2 h的效果最好。采用2%牛血清白蛋白作为封闭剂的效果最好。在31.25~1 000 ng/ml浓度范围内,牛乳铁蛋白的logit(B/B0)与牛乳铁蛋白浓度的对数值呈显著的线性关系,其回归方程为y=-1.899 1x+5.043 3(R2=0.987 3)。[结论]该研究为研制用于奶牛乳腺炎诊断的牛LF检测试剂盒奠定基础。 相似文献
16.
为了对近年从郑州郊区鸡群中分离到的1株传染性支气管炎病毒(Jin13株)进行定型鉴定,作者采用气管环(TOC)中和试验、血凝抑制(HI)试验、单抗交叉ELISA、序列分析和免疫试验对其进行了研究。气管环(TOC)中和试验和血凝抑制(HI)试验表明Jin13病毒只与M41阳性血清反应,而与其它ND、EDS76、H9AI、IBD标准阳性血清不发生反应,序列分析证实该分离毒Jin13株是IBV。在交叉气管环(TOC)中和试验和交叉血凝抑制(HI)试验中Jin13株与肾变型Y株不交叉(R≤0.25),而与马萨株血清型的M41株和H52株有明显交叉(0.25≤R≤0.8);单抗交叉ELISA结果显示Jin13株与针对M41株的J1单抗有很好的反应(≥640～1 280),而与针对肾变型Y株的单抗C2几乎不反应(≤40),这进一步证实了Jin13与呼吸型M41株、H52株属同一血清型。与M41株相比较,Jin13株S1氨基酸序列在第126,386,390,461位出现了突变,又在S1基因第1 166位出现一个新Aiu I酶切位点,是M41株的一个变异株。对Jin13株纯化后原代毒进行免疫效力检测证实其免疫原性优于M41株和H52株。Jin13毒株是一株免疫原性良好的IBV地方流行毒株。 相似文献
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【目的】克隆牛筋草（Eleusine indica）中草甘膦的靶标基因EPSPS，获得牛筋草EPSPS重组蛋白并制备其单克隆及多克隆抗体，组装酶联免疫试剂盒，检测牛筋草植株不同组织EPSPS的表达水平及蛋白含量，为快速鉴定抗性牛筋草提供简便工具。【方法】利用PCR方法克隆EPSPS基因全长；构建pET30a-EPSPS阳性质粒并转化宿主菌BL21，经IPTG诱导表达后获得重组蛋白；利用该重组蛋白免疫小鼠与新西兰大白兔，制备单克隆及多克隆抗体，并利用Western blot检测特异性；利用间接ELISA方法进行免疫配对试验，筛选出最佳配对抗体，优选各试剂工作浓度并组装试剂盒；用研制的试剂盒对不同种群牛筋草进行EPSPS含量检测，并与qPCR结果分析比较。【结果】牛筋草EPSPS的开放阅读框含有1 620 bp的核苷酸，编码540个氨基酸，理论等电点为8.80，该蛋白无跨膜区域。进化树分析结果表明牛筋草EPSPS与水稻EPSPS进化关系最近。诱导蛋白表达的培养条件为1 mmol·L-1的IPTG，25℃，获得了纯度大于90%，浓度为3 mg·mL-1的重组蛋白12 mg；编号为R1711和R1712的家兔免疫后产生的多克隆抗体有较高的效价，编号为M171070、M171071、M171072的小鼠产生的单克隆抗体效价较高。进一步筛选出单抗FL-374-08能与多克隆抗体组成最佳配对抗体；酶联免疫试剂盒包被抗体的最优质量工作浓度为2 μg·mL-1，酶标抗体的最优工作浓度为10 μg·mL-1；试剂盒线性检测范围为5—80 μg·kg-1，检出限为5 μg·kg-1。抗性牛筋草植株叶片中EPSPS的表达量是敏感植株的52.9倍，而茎中EPSPS的表达量是敏感植株的63.0倍。在抗性牛筋草叶片中EPSPS相对拷贝数是敏感植株的53.5倍，而茎中EPSPS的相对拷贝数是敏感植株的78.6倍。Western blot结果表明单抗与牛筋草EPSPS有特异性免疫，并能准确区分不同敏感性植株及不同组织的蛋白含量差异。酶联免疫检测结果发现抗性牛筋草茎中的EPSPS浓度可以达到6.0 μg·L-1，而敏感植株叶片和茎中EPSPS蛋白的浓度分别为0.22和0.43 μg·L-1。【结论】获得的牛筋草EPSPS单克隆抗体特异性强、灵敏度高，研发的EPSPS酶联免疫试剂盒能够快速、准确检测牛筋草EPSPS蛋白含量并鉴定牛筋草由EPSPS过量表达导致的草甘膦抗药性。 相似文献
18.
将复性的重组NDV HN蛋白免疫BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤.通过ELISA筛选,获得了1株稳定分泌抗HN单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞4E11.ELISA和Western-blot结果表明,该MAb能与NDV特异性反应,而不与H9亚型AIV,IBDV,EDS76,IBV和CIAV交叉... 相似文献
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犬瘟热病毒F蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
[目的]获得犬瘟热病毒F蛋白特异性单克隆抗体。[方法]用纯化的大肠杆菌BL21表达的犬瘟热病毒重组F蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用传统的杂交瘤技术制备单克隆抗体。用ELISAI、FA、Western-blot、细胞中和试验鉴定各株单抗的生物学特性。[结果]获得7株稳定分泌犬瘟热F蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2D6,3E10,3A2,5B7,5F6,6H8,9B6);单抗亚类鉴定结果分别为IgG2a,IgG1,IgG2b,IgG1,IgG1,IgG2a和IgG1;细胞中和试验初步证实2株单抗(5B7,9B6)具有中和犬瘟热病毒感染Vero细胞的作用,中和效价分别为1∶320和1∶640;经ELISA相加试验证实7株单抗的作用位点不同,其中2D6,5F6的作用位点非常相近。[结论]该研究成功制备了7株抗犬瘟热F蛋白特异性单抗,为进一步研究犬瘟热病毒F蛋白和临床诊断打下良好的基础。 相似文献