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1.
目的表达小反刍兽疫病毒H蛋白的主要抗原位点用于检测与预防。方法用DNAStar分析小反刍兽疫病毒H基因的主要抗原位点,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从病羊组织中扩增PPRV的H基因的主要抗原位点并克隆到原核表达载体PET-28b中,最后用PCR、酶切和测序分析对重组质粒进行鉴定;将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中,经不同浓度的IPTG诱导表达PPRVH基因的主要抗原位点;用SDS-PAGE和Western-blotting分析所有蛋白的表达。结果将RT-PCR产物电泳,得到与预期大小相符的特异性片段;对重组质粒PET-28b-H66-249和PET-28b-H281-550酶切后,均出现预期相符的片段;DNA测序表明插入片段的序列与小反刍兽疫H蛋白基因完全一致,其大小分别为569bp和831bp;将重组表达的蛋白经SDS-PAGE和Western-blotting检测,证明所有的蛋白均得到表达。结论成功表达了PPRVH基因的主要抗原蛋白,为日后的检测与预防工作奠定了基础。 相似文献
2.
马传染性贫血病毒受体基因的原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
为了构建马传染性贫血病毒受体(ELR1)的原核表达体系,克隆ELR1的编码区基因,将其亚克隆到PET-30a构建重组表达质粒PET-30a-ELR1,经酶切和DNA测序鉴定,将阳性质粒转化E.coli BL21感受态细胞,IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE电泳及Westhern-blot分析鉴定,结果表明:该基因在大肠杆菌中以包涵体形式表达,其表观分子质量约为39.6 ku;利用尿素洗涤纯化可以得到具有较高纯度的表达蛋白,是一种理想的免疫原. 相似文献
3.
根据GenBank收录的鹅细小病毒(GPV)基因序列,设计并合成了一对VP3基因扩增引物。采用PCR技术对SS/10株的VP3基因进行扩增,将目的基因和原核表达载体PET-32a分别经HindⅢ和BamHⅠ双酶切后进行连接,获得重组质粒PET-32a-VP3,并将其转化表达菌BL21(DE3)pLysS。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,结果获得了72ku左右的融合蛋白,大部分以包涵体的形式存在于菌体中。Wesern blot结果表明,该蛋白能与GPV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。 相似文献
4.
《中国动物传染病学报》2017,(5)
为获得可用于诊断的猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2蛋白重组抗原,对CSFV-E2的多个B细胞抗原表位进行重构和表达。将人工合成的E2蛋白多抗原表位基因与p ET-28a(+)载体连接后,转化至宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析蛋白可溶性,His亲和层析柱纯化蛋白并进行抗原性检测。重构后的猪瘟病毒E2基因多抗原表位基因大小约500 bp,PCR、双酶切鉴定结果显示与预期相符;重组蛋白为可溶性表达,大小约23 k Da;Western blot结果显示,重组蛋白可与猪瘟阳性血清发生特异性结合,具有良好的免疫反应性,可作为诊断抗原用于猪瘟病毒感染动物的血清抗体检测。 相似文献
5.
猪瘟病毒NS4B蛋白是猪瘟病毒编码的一个非结构蛋白,由347个氨基酸残基组成。NS4B在病毒中可能与致细胞病变有关,具体功能尚不清楚。本试验利用PCR扩增NS4B基因,利用双酶切、连接和转化等操作方法,与质粒载体p EGFP-N3构建成真核表达重组质粒,双酶切检测猪瘟病毒NS4B真核表达载体构建成功。测定重组质粒序列,并验证表达成功,为今后的功能研究奠定了基础。 相似文献
6.
为建立基于猪瘟病毒E2基因主要抗原区表达产物的猪瘟抗体斑点杂交ELISA方法,应用RT-PCR方法扩增了猪瘟病毒E2基因的主要抗原区(dE2),经EcoR I、Xho I双酶切,与经同样双酶切的原核表达载体pET-28a (+)连接,加入适量IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,成功表达的重组蛋白分子量约32.4 KDa,能与CSFV阳性血清特异性结合,为CSFV抗体检测提供了有效工具。 相似文献
7.
重组猪瘟病毒E2基因逆转录病毒载体的构建及其表达活性 总被引：4，自引：0，他引：4
从实验感染兔脾组织中提取总RNA，应用RT—PCR得到了CSFVC-株结构蛋白E2基因，定向克隆于逆转录病毒载体pBABEpuro，经PCR、酶切和序列分析鉴定，获取阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒载pVSV—G共转染GP2—293细胞，收获假型病毒，并在Polybrene的介导下感染PK15细胞，嘌呤霉素筛选表达猪瘟E2基因的细胞株。通过细胞传代并结合PCR、免疫荧光及ELISA检测表明，所筛的细胞细胞系能稳定表达猪瘟E2基因，而且表达产物具有良好的生物学活性。 相似文献
8.
猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
将猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)基因进行克隆、表达,并获得纯化重组蛋白,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp的功能奠定基础.以RdRp基因cDNA为模板,用PCR扩增出RdRp基因片段,应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pET32a(+)重组,阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定,IPTG诱导高效表达.PCR法扩增出720 bp的片段,酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒,在大肠埃希菌LB21中表达得到分子质量约为46 ku的融合蛋白.成功克隆及表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因. 相似文献
9.
将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果显示,获得了含VP2基因和E290基因的重组质粒pM-VP2-E290,昆虫细胞sf9的表达产物经SDS-PAGE、Western-blot检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为67 ku,且具有天然蛋白的抗原特性。免疫电镜观察可见表达产物形成的病毒样颗粒。证实,成功构建了同时含有PPV VP2基因和CSFV特异性T细胞表位基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达。 相似文献
10.
PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)LTB、STⅠ、STⅡ基因,将LTB、STⅠ、STⅡ基因重组入pET32a质粒载体,对构建的重组质粒pBST进行酶切分析、PCR检测以及核苷酸序列分析,结果表明,插入片段LTB-STⅡ-STⅠ的核苷酸序列与预期一致,且阅读框正确.pBST在宿主菌BL21(DE3)RIL中的表达产物经SDS-PAGE初步分析,显示重组融合蛋白的分子量约为40kD,其表达量约占菌体总蛋白的46%. 相似文献
11.
猪瘟病毒E2基因抗原结构域A、B、C、D区在大肠杆菌中的表达 总被引：4，自引：0，他引：4
采用PCR技术扩增出猪瘟病毒E2基因抗原结构域A、B、C、D区并克隆于PGEM-T easy载体上，测序结果表明插入的为猪瘟病毒E2基因抗原结构域，切出目的基因，将目的基因克隆到表达质粒pProEX—HTb中，获得重组质粒经PCR、酶切和序列分析鉴定E2基因抗原结构域插入的位置、大小和读码框均正确，SDS—PAGE检测表明受体菌经IPTG诱导后能表达E2基因抗原结构域蛋白，Westernblot检测表明受体菌诱导表达E2基因抗原结构域蛋白可与猪瘟阳性血清发生特异性反应。 相似文献
12.
鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白GFP融合分子在COS7细胞内的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
将鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP2蛋白基因插入增强型绿色荧光表达载体pEGFP-C1中,构建了真核表达载体pEGFP-VP2。PCR与酶切鉴定结果表明VP2基因成功插入到表达载体pEGFP-C1中。脂质体法转染COS7细胞后,荧光显微镜检测到了GFP-VP2融合蛋白的表达。用200 μg/ml的G418成功筛选到了稳定表达GFP-VP2融合蛋白的细胞系,表达蛋白经镍亲和柱得到了纯化。 相似文献
13.
构建表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的siRNA重组伪狂犬病病毒3株,将其感染PK-15细胞,在细胞水平上评价重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对N蛋白表达的抑制效果.PCR扩增带CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因,通过酶切将CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因分别插入伪狂犬病病毒转移载体pUSKBH中,构建重组伪狂犬病病毒通用转移载体pUsiRNA.分别用BamH Ⅰ和HindⅢ酶切pUsiRNA,回收后与HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的3个siRNA分子连接,构建表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒表达载体.将鉴定正确的重组伪狂犬病病毒表达载体与伪狂犬病病毒DNA共转染PK-15细胞,经同源重组及噬斑纯化获得表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒株,应用PCR及Southern blot鉴定重组病毒.将HN1株N蛋白基因的真核表达质粒pAcGFP1-N转染PK-15,经筛选获得稳定表达N蛋白基因的细胞.将鉴定正确的表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒接种于稳定表达N蛋白基因的细胞,利用绿色荧光蛋白基因及半定量RT-PCR检测重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA对N蛋白表达的抑制效果.结果显示,PCR扩增到的CMV-siR-NA-poly(A)片段约为0.7kb,新霉素基因约1.5kb.经酶切、PCR及测序鉴定,构建了表达siRNA的通用伪狂犬病病毒转移载体pUsiRNA.经PCR及Southern blot检测,获得了3株表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒gG-/siRNAN1、gG-/siRNAN2和gG-/siRNAN3;经荧光显微镜观察和半定量RT-PCR检测表明,重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA能够显著抑制N蛋白在PK-15细胞中表达,其中gG-/siR-NAN2抑制效果最好.这为深入研究N蛋白基因siRNA抑制HP-PRRSV复制奠定基础,并为HP-PRRSV的防制提供新的思路. 相似文献
14.
《畜牧与兽医》2015,(6):7-11
根据猪瘟病毒衣壳蛋白(Core)基因序列设计一对特异性引物,RT-PCR从猪瘟兔化弱毒中扩增出完整的Core基因,经酶切和序列测定后,克隆到携带His标签的原核表达载体p ColdⅠ中,成功构建了重组质粒p Cold-Core,并转化到大肠杆菌Rosseta 2(R2)中;利用IPTG诱导表达目的蛋白并鉴定表达效果。结果表明:经终浓度为0.1 mmol/L IPTG诱导24 h后,Core基因在R2中获得分泌性可溶表达,表达量占菌体蛋白的32.6%,SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量为20 ku。Western blot结果显示Core蛋白可以分别与His单抗和猪瘟病毒阳性抗血清发生特异性反应,均出现单一反应带。将目的蛋白切胶后免疫Balb/c小鼠,制备特异性抗血清,Western blot结果显示该抗血清与衣壳蛋白反应后有明显的特异性条带,经激光共聚焦鉴定抗血清能够与胞浆中的猪瘟病毒粒子发生反应。结果表明,Core基因表达成功,制备的抗血清具有生物学功能。本研究为深入探讨Core蛋白在猪瘟病毒致病机制上的作用奠定了基础。 相似文献
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新城疫病毒F基因在大肠埃希菌中的表达及其抗原性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
构建新城疫病毒融合蛋白F基因的原核表达载体,并将其在宿主菌BL21(DE3)感受细胞中表达.以含有融合蛋白F基因的重组质粒pMD19T-F为模板,设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得F基因的F1片段,定向插入原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-F1,将构建成功的重组质粒pET-F1转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导,将其在宿主菌细胞中表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot方法检测.结果显示,成功克隆出了新城疫病毒F1基因片段序列852 bp.构建的pET-F1载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误,转化表达宿主菌后经SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,目的基因被成功表达,并具有良好的反应原性.成功构建了新城疫病毒的融合蛋白F基因原核表达载体,转化宿主细胞后成功表达了融合蛋白F1重组蛋白片段. 相似文献
16.
产肠毒素大肠杆菌肠毒素LTB、STI和STⅡ融合基因的构建与表达研究 总被引：6，自引：0，他引：6
PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,FTEC)LTB、STI、STⅡ基因，将LTB、STI、STⅡ基因重组入pET32a质粒载体，对构建的重组质粒pBST进行酶切分析、PCR检测以及核苷酸序列分析，结果表明，插入片段LTB－STⅡ－STI的核苷酸序列与预期一致，且阅读框正确。pBST在宿主菌BL21（DE3）RIL中的表达产物经SDS－PAGE初步分析，显示重组融合蛋白的分子量约为40kD，其表达量约占菌体总蛋白的46％。 相似文献
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以鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株基因组RNA为模板,通过RT-PCk扩增VP1基因,经EcoRI和和Xho I双酶切处理后与经相同酶切处理的pET-30a原核表达载体连接,将酶切、PCR及测序鉴定正确的阳性重组子转化BL21(DE3)感受态细胞,融合蛋白His-VP1经IPTG诱导表达后主要以包涵体形式存在.Western blot检测到约97 ku的目的蛋白能够与特异性的VP1单克隆抗体反应.将纯化的目的蛋白免疫新西兰白兔后获得了抗VP1蛋白的血清.该血清能够与重组杆状病毒rBacGxVP1感染的sf9细胞发生特异性反应,而且其ELISA抗体效价达到1:25 600.鸡传染性法氏囊病超强毒VP1基因的表达与兔抗血清的制备为病毒的检测及VP1功能的研究提供了有效工具. 相似文献
18.
基于猪瘟病毒主要保护性抗原E2囊膜糖蛋白有两个相对独立的抗原结构单位B/C抗原区和A/D抗原区,根据GeneBank中猪瘟病毒B/C基因核苷酸序列设计合成一对引物,经RT-PCR扩增猪瘟病毒B/C基因。将扩增所得猪瘟病毒B/C基因克隆于PMD18-T载体,然后定向亚克隆猪瘟病毒B/C基因至原核表达载体PET30(a)的多克隆位点中,经酶切鉴定后,将含有B/C基因的重组质粒命名为PETB/C。用PETB/C转化受体菌BL21,挑取单个菌落,用诱导剂IPTG以不同浓度进行诱导,并在不同诱导时间收集样品。经SDS-PAGE电泳分析证实B/C基因获得了表达,并在终浓度为1mM的IPTG,诱导6h其表达达到高峰,经Western-blot分析证实表达的重组B/C蛋白具有反应活性,大小约为9KD。用表达产物作ELISA,结果表明表达产物与猪瘟病毒抗血清可发生明显的反应,而与其它8种疫病阳性血清不发生反应。正常菌体蛋白与猪瘟病毒阳性血清也不发生反应。通过对58份送检血清样品的检测结果显示其与Dot-ELISA的相符率高达95%以上。试验证明利用原核表达系统制备的重组蛋白作为诊断用抗原,为研究亚单位疫苗或诊断抗原打下坚实基础。 相似文献
19.
《中国兽医杂志》2018,(8)
为了表达非洲猪瘟K205R蛋白,进而制备其多克隆抗体,为非洲猪瘟血清学检测方法的建立奠定基础。以合成的K205R基因为模板,PCR扩增该基因序列,并将其克隆至原核表达载体p ET-21a中,得到重组质粒p ET-21a-ASFV-K205R。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达His-ASFV-K205R融合蛋白,通过亲和层析的方法纯化His-ASFV-K205R融合蛋白。通过Western Blot方法鉴定融合蛋白的抗原性,以此融合蛋白为抗原免疫兔制备多克隆抗体,通过ELISA的方法测定多抗效价。结果表明,原核表达的K205R蛋白具有很好的抗原性,制备的兔多克隆抗体效价为1∶128 000,为建立非洲猪瘟的血清学检测方法提供生物材料。 相似文献
20.
体外表达猪瘟病毒(CFSV)T、B细胞表位,并对表达产物的免疫原性进行分析.人工合成CFSV的多个T、B细胞表位及表位之间的连接linker基因,并将该基因插入pGEX-6P-1表达载体,经酶切和测序鉴定获得重组阳性克隆,成功构建了CFSV复合多表位抗原基因的原核表达质粒pGEX-BT500,转化E.coli BL21,IPTG诱导表达,纯化表达产物并免疫兔.结果:通过IPTG诱导目的基因可高效表达,SDS-PAGE结果表明,以终浓度为0.9 mmol· L-1的IPTG进行诱导,7h后表达量最高,产物分泌表达,相对分子质量约43 ku,表达产量约占菌体总蛋白的30％.Western blotting检测表明,表达的融合蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应;兔攻毒试验表明所免疫表达产物可保护(根据发热反应评价)兔.结果表明表达获得的产物具有良好的反应原性,这为应用该融合蛋白制备CSFV免疫血清学诊断试剂和多表位疫苗研究奠定了基础. 相似文献