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基于海口市动物基因工程重点实验室获得的牛乳状瘤病毒13型(BPV-13)基因组序列信息(GenBank登录号:KM258443.2),以基因组为模板,扩增E5基因片段,将其连入pEGFP-N1质粒,构建重组质粒pEGFP-E5-N1,测序正确后瞬时转染HEK293细胞,应用荧光显微镜、流式细胞仪、Western blotting 鉴定融合蛋白的表达。结果显示,E5片段大小为135 bp;重组质粒pEGFP-E5-N1构建正确;荧光显微镜下观察转染重组质粒pEGFP-E5-N1的HEK293细胞,可见明亮的绿色荧光;流式细胞术分析结果显示,转染重组质粒pEGFP-E5-N1 48 h后,约55.59% 的细胞表达绿色荧光蛋白;Western blotting结果表明,表达的融合蛋白大小约为32 ku。本试验结果为下一步研究E5基因的作用机理奠定了基础。 相似文献
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构建FMDV 2A介导的人白细胞介素2基因(hIL-2)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子乳腺特异性表达载体,并验证其在乳腺上皮细胞中的表达.克隆奶山羊β-酪蛋白启动子序列,将hIL-2基因序列置于启动子之后,然后利用口蹄疫病毒2A(FMDV 2A)自剪切序列连接EGFP基因,构建出乳腺特异性的双顺反子表达载体pFIENβ,并利用脂质体转染山羊乳腺上皮细胞,然后用RT-PCR技术和Western blot检测hIL-2基因与EGFP基因的表达.重组质粒pFIENβ经酶切鉴定后表明构建成功,转染质粒PFIENβ和pEGFP-C1的细胞均观察到绿色荧光;从转染pFIENβ的乳腺上皮细胞中扩增出hIL-2基因和EGFP基因,而转染pEGFP-C1的细胞中只扩增出EGFP基因;经Western blot检测,转染pFIENβ的细胞中均表达了hIL-2和EGFP蛋白.结果表明山羊β-酪蛋白启动子能同时启动hIL-2基因和EGFP基因在山羊乳腺上皮细胞中的表达,并且利用FMDV 2A元件实现了hIL-2基因和EGFP基因的非融合型表达. 相似文献
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《中国兽医学报》2014,(10)
本研究采用SOE-PCR技术,分别获得了CTCF因子结合序列的突变和缺失的序列,构建2个重组质粒pEGFP-N1/1554M和pEGFP-N1/1549。质粒pEGFP-N1/1554M由CTCF因子的结合序列CCCTC突变为TAAGT后的序列替换pEGFP-N1的CMV启动子构建而成;质粒pEGFP-N1/1549由CTCF因子结合序列CCCTC缺失后序列(长1 549bp)替换pEGFP-N1的CMV启动子构建而成。用重组质粒分别转染牛乳腺上皮细胞(BMEC),经筛选获得稳定的单克隆细胞,测定荧光强度并与对照组pEGFP-N1/1554(未缺失)比较荧光强度。结果表明,质粒pEGFP-N1/1554M的启动子活性显著强于对照组(P<0.01),质粒pEGFP-N1/1549的启动子活性显著强于对照组(P<0.01);即CTCF因子结合位点突变和缺失后,bLTF基因启动子活性都显著增强。 相似文献
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为获得293T细胞表达的ALV-J gp85蛋白,研究通过PCR扩增ALV-J gp85基因,利用基因克隆技术克隆pMD-18T-gp85并测序,进而构建表达质粒p EGFP-N1-gp85。利用293T细胞对重组表达质粒进行表达,通过荧光显微镜和Western blot检测重组表达质粒(pEGFP-N1-gp85)的表达情况。结果显示,pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中均匀分布,说明pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中表达;pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中表达的蛋白质分子质量约为60 ku。结果表明,成功构建了真核表达质粒pEGFP-N1-gp85,并在293T细胞中获得了表达,为研制ALV-J-gp85 DNA核酸疫苗提供了科学支撑。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2020,(5)
为了探究由干扰素刺激基因15(ISG15)编码产生的ISG15蛋白的表达特性,及其对犬瘟热病毒(CDV)感染过程的影响,以及在CDV致宿主免疫抑制过程中的作用,试验设计并合成了针对ISG15基因的特异性引物,提取宿主细胞总RNA,反转录成cDNA后利用RT-PCR方法扩增ISG15全基因序列,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、回收纯化目的片段后将其插入到pEGFP-N1真核表达载体中,构建pEGFP-ISG15重组质粒。PCR和双酶切鉴定重组质粒后测序,将阳性重组质粒转染至HEK293T细胞中进行荧光显微镜观察和Western-blot分析。结果表明:经PCR扩增和双酶切鉴定得到与目的片段大小相符的片段,且测序结果证实重组质粒pEGFP-ISG15构建成功,转染HEK293T细胞24 h后可在荧光显微镜下观察到绿色荧光信号,Western-blot可检测到与目的蛋白大小一致的融合蛋白。说明试验构建的重组质粒pEGFP-ISG15可在体外成功表达ISG15蛋白。 相似文献
8.
为了正确表达禽呼肠孤病毒(ARV)σA蛋白,试验拟构建σA基因的真核表达质粒,并将其在人胚肾细胞(HEK293T)中准确表达,参照GenBank中ARV S2基因序列(登录号为KF741763. 1)设计特异性引物,以pMD18-T-σA重组载体为模板,应用PCR的方法扩增σA基因的特异性序列,并将其克隆到p MD18-T载体中,构建重组pMD18-T-σA表达质粒,再用限制性内切酶KpnⅠ和NotⅠ同时双酶切pMD18-T-σA和真核表达质粒pEF1α-HA,将胶回收的σA基因和pEF1α-HA进行连接,构建真核表达质粒pEF1α-HA-σA。真核表达质粒经菌落PCR、双酶切和测序验证正确后,将其转染HEK293T细胞,于24 h后收取蛋白质,通过Western-blot验证目的蛋白。结果表明:本试验成功克隆了ARVσA基因,构建了其真核表达质粒pEF1α-HA-σA,并在HEK293T细胞中表达。说明该蛋白可以在HEK293T细胞中准确表达。 相似文献
9.
《中国兽医学报》2018,(11)
将H5N1型禽流感病毒NS1(non-structural protein 1)基因插入pEGFP-N1真核表达载体中,获得重组质粒pNS1-EGFP,经酶切鉴定并测序后,去内毒素提取pNS1-EGFP质粒,在脂质体转染试剂作用下将pNS1-EGFP质粒转染HEK293细胞,利用倒置荧光显微镜、FCM和Western blot 3种方法检测NS1-EGFP融合蛋白的表达,利用极限稀释的方法获取单细胞,并利用G418抗性筛选获取稳定细胞系。结果显示,NS1基因正确插入pEGFP-N1真核表达载体,NS1-EGFP融合蛋白读码框架正确;3种检测方法表明,NS1-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中能够表达;pEGFP-N1和NS1-EGFP稳定细胞系流式细胞仪检测,阳性率分别为95.74%和96.10%,Western blot检测结果发现,HEK293空白细胞和pEGFP-N1稳定细胞系未见任何条带,NS1-EGFP稳定细胞系在51 000处见特异性条带,综上说明稳定细胞系构建成功。本试验为进一步深入研究禽流感病毒NS1基因的生物学功能作铺垫。 相似文献
10.
旨在探究SIGIRR对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)TLR4信号通路的负调控作用。构建SIGIRR-pEGFP真核表达载体,脂质体法转染HEK293T及BMECs,荧光显微镜观察及Western blot验证融合蛋白SIGIRR-pEGFP的表达;LPS刺激转染后BMECs,检测TLR4及其信号通路分子IRAK1、IRAK4和TRAF6的变化,以及下游炎性因子IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α的表达量。结果显示,成功构建SIGIRR-pEGFP真核表达载体,荧光检测重组质粒转染到HEK293T和BMECs中;Western blot鉴定融合蛋白SIGIRR-pEGFP表达正确;重组质粒转染BMECs后,SIGIRR表达量较转染空载质粒组及空白未转染组显著升高(P0.01);炎性因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α、TLR4及下游信号分子IRAK1、IRAK4、TRAF6表达量显著降低(P0.01),转染空载质粒组与空白未转染组相比仅IRAK1表达量有差异(P0.05)。结果表明,本试验通过研究牛SIGIRR在BMECs中的作用,证实SIGIRR基因具有炎性负调控LPS-TLR4信号通路的作用,具有潜力成为临床治疗奶牛乳腺炎的新靶标。 相似文献
11.
根据GenBank上发表的牛舌抗菌肽(Lingual antimicrobial peptide,LAP)基因cDNA序列设计1对特异引物,从患乳腺炎的奶牛乳腺组织中以RT-PCR方法扩增LAP基因片段,将其克隆到pMD19-T Simple载体中测序。重组质粒经EcoRⅠ+BamHⅠ双酶切回收目的基因片段,亚克隆入增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1中构建重组融合表达质粒pEGFP-LAP,将其脂质体转染COS-7细胞,经荧光显微镜观察到融合表达的绿色荧光蛋白,采用RT-PCR检测到LAP基因在COS-7细胞中转录。pEGFP-LAP重组表达质粒的成功构建为进一步研究奶牛LAP基因的表达特性及利用基因工程技术防治奶牛乳腺炎奠定了基础。 相似文献
12.
本研究以测序质粒为模板,扩增出结构蛋白基因ORF2a-ORF7,将此基因片段插入真核表达栽体pEGFP-N3中构建重组质粒pEGFP-N3-(ORF2a～ORF7),然后将重组表达质粒转染293T细胞.通过荧光显微镜观察显示,重组质粒pEGFP-N3-(ORF2a～ORF7)和载体pEGFP-N3均有绿色荧光出现.SDS-PAGE电泳和western blot分析结果表明重组质粒pEGFP-N3-(ORF2a～ORF7)和载体pEGFP-N3均有EGFP表达;仅ORF7有43 ku的融合蛋白EGFP出现,与预期大小相符;其他重组质粒pEGFP-N3-(ORF2a～ORF6)均没有融合蛋白出现.本实验为进一步研究这些蛋白的结构和生物学功能奠定了基础. 相似文献
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为了构建真核重组荧光质粒pEGFP-N1-Et HP,并筛选出Lipofectamine 2000介导的高效转染细胞,本试验将柔嫩艾美尔球虫假定蛋白(Et HP)基因扩增后插入真核荧光表达载体pEGFP-N1,构建真核重组荧光质粒pEGFP-N1-Et HP;测序成功后,用Lipofectamine 2000介导pEGFP-N1-Et HP转染4种细胞即Vero、DF-1、BHK、HD-11;用Western blot检测确定Et HP蛋白在4种细胞内的表达,并观察转染48 h后荧光表达情况,计算5个视野内带有绿色荧光的细胞数占细胞总数的比例,从而比较质粒与Lipofectamine 2000比例不同时4种细胞的转染效率[转染效率/%=(带有绿色荧光的细胞数/细胞总数)×100%]。测序结果显示,pEGFP-N1-Et HP构建成功。Western blot检测显示,Et HP蛋白在4种细胞中均成功表达;荧光显微镜观察到4种细胞转染后48 h均出现绿色荧光,表明重组质粒pEGFP-N1-Et HP成功表达。通过转染效率的比较,发现DF-1细胞转染效率均显著高于其他细胞(P<0.0... 相似文献
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本试验旨在构建带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP及目的基因泛素化调节因子2(Smurf2)的真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,并转染小鼠肾小管上皮细胞检测其表达情况。用RT-PCR法扩增小鼠肾小管上皮细胞Smurf2的CDS区,构建克隆载体pEASY-Zero-Smurf2和真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,酶切并测序鉴定。运用脂质体转染法将pEGFP-N3-Smurf2真核表达载体转染小鼠肾小管上皮细胞,实时荧光定量PCR、免疫印迹检测Smurf2的表达。PCR结果显示扩增出Smurf2基因片段大小约为2247 bp;重组质粒pEGFP-N3-Smurf2的酶切鉴定及测序结果均表明Smurf2基因成功克隆到真核表达载体中;脂质体转染后检测结果显示,转染pEGFP-N3-Smurf2表达载体的肾小管上皮细胞中Smurf2基因mRNA表达量升高且EGFP-Smurf2重组蛋白有表达。本试验成功构建了含有增强型绿色荧光蛋白标记的Smurf2真核表达质粒,转染后能明显提高细胞内Smurf2的表达,为研究Smurf2基因的功能奠定了基础。 相似文献
16.
旨在构建PLCζ真核表达载体,初步研究其在体细胞系中的表达特性。本研究用PCR技术扩增出PLCζ基因片段,克隆至载体pEGFP-N1,鉴定无误后,将构建了重组质粒pEGFP-N1-PLCζ转染293T细胞和绵羊成纤维细胞,在倒置荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察重组质粒在细胞中的表达和分布。经酶切与测序证明,本试验成功的构建了pEGFP-N1-PLCζ真核表达载体,并且成功与绿色荧光蛋白融合表达。本试验实现了pEGFP-N1-PLCζ在绵羊胎儿成纤维细胞中的表达,这将有利于进一步通过核移植来研究其重组蛋白对卵母细胞的激活作用。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2019,(5)
为探讨非结构蛋白2(non-structural protein 2,NSP2)在猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)复制过程中的作用及机制,本研究构建真核重组质粒pc DNA 3.1-5'Flag-NSP2-147-323,并瞬时转染至HEK293T中,同时设置完整NSP2基因序列重组质粒作为对照,转染48 h后分别用不同的抗体进行间接免疫荧光监测。结果显示,转染对照组中细胞核周围可见特异性荧光,而转染真核重组质粒pc DNA 3.1-5'Flag-NSP2-147-323后,不仅在细胞核周围,在细胞核内也可以观察到特异性荧光。本研究成功构建真核重组质粒pc DNA 3.1-5'Flag-NSP2-147-323,并可在HEK 293T细胞中正确表达,为进一步研究NSP2在PRRSV复制过程中的作用提供依据和基础。 相似文献
18.
AIM2炎症复合体参与自身免疫性疾病和机体抵御病原体的过程,研究其激活机制具有重要的意义。为构建AIM2炎症复合体的体外活化体系,本研究通过PCR方法从人单核细胞(THP-1细胞)中扩增AIM2、ASC、pro-Caspase-1、 pro-IL-1β基因片段后,构建重组质粒p3×Flag-AIM2、 p3×Flag-ASC、 p3×Flag-pro-Caspase-1和p3×Flag-pro-IL-1β,分别转染HEK293T细胞后采用western blot鉴定各蛋白的表达。结果显示,分别约在41.9 ku、34.1 ku、 48.5 ku、 24.6 ku处出现特异性条带,表明融合Flag标签的AIM2、 ASC、 Caspase-1和IL-1β蛋白在HEK293T细胞中获得了表达。除此之外,还可以在HEK293T细胞中检测到39 ku的内源性AIM2蛋白特异性条带,表明HEK293T细胞自身也表达内源性AIM2蛋白。将不同浓度比例的上述重组质粒转染或共转染HEK293T细胞,24 h后各组再转染poly(dA:dT),采用间接ELISA检测各组细胞中IL-1β的分泌水平。结果显... 相似文献
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为了构建叉头框L2(Forkhead box L2,FOXL2)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因复制缺陷型腺病毒载体,试验将克隆的FOXL2基因与IRES-GFP片段通过酶切、纯化等方法共同连接到pShuttle-CMV载体中,再与pAdEasy-1腺病毒质粒在BJ5183大肠杆菌中进行同源重组,得到复制缺陷型AD-FOXL2腺病毒载体,再用PacⅠ酶线性化后转染HEK293细胞,观察绿色荧光表达,并测量病毒效价。结果表明:将AD-FOXL2腺病毒载体用PacⅠ酶线性化后,得到1个大于23 kb的大片段和1个4.5 kb的特异性小片段,证明同源重组成功;将所得的腺病毒载体转染HEK293细胞,可以观察到GFP的表达,证明包装成功,并测得病毒效价为1×10-8.61/0.1 mLTCID50。 相似文献
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本研究旨在克隆奶牛脑肌类芳香烃受体核转位蛋白1基因（Brain and Muscle Arnt-Like Protein 1,BMAL1）的蛋白编码序列（Coding Sequence,CDS）并构建其真核表达载体,运用生物信息学方法解析其CDS序列和编码蛋白特性。以牛肝脏组织为材料,利用PCR技术扩增奶牛BMAL1基因中带有同源臂的CDS片段。采用同源重组法,将目的片段连接至酶切线性化的pc DNA3.1-Puro-N-3HA真核表达载体上,酶切及测序结果均符合预期的质粒命名为pc DNA3.1-3HA-c BMAL1。将空载与重组质粒分别转染至HEK293T细胞,通过实时荧光定量PCR技术（q PCR）和Western Blotting技术检验奶牛BMAL1基因的过表达效果,并利用生物信息学软件分析BMAL1基因CDS区及其编码蛋白的特性和功能。结果显示,pc DNA3.1-3HA-c BMAL1真核表达载体构建成功,将该质粒转染至HEK293T细胞后,成功实现了BMAL1在m RNA和蛋白水平的过表达;牛BAML1基因与绵羊、山羊同源性最高,BMAL1蛋白为不稳定蛋白,其上不存在... 相似文献