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1.
猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
将猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)基因进行克隆、表达,并获得纯化重组蛋白,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp的功能奠定基础.以RdRp基因cDNA为模板,用PCR扩增出RdRp基因片段,应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pET32a(+)重组,阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定,IPTG诱导高效表达.PCR法扩增出720 bp的片段,酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒,在大肠埃希菌LB21中表达得到分子质量约为46 ku的融合蛋白.成功克隆及表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因. 相似文献
2.
根据GenBank发表的奶牛白细胞介素2(IL-2)基因序列,设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增奶牛IL-2基因,琼脂糖电泳显示扩增出的片段约为477bp。回收片段,克隆入pMD18-T载体,经菌落PCR、酶切及重组质粒PCR鉴定,测序结果显示,克隆的奶牛IL-2基因与GenBank发表的奶牛IL-2基因序列同源性为98.7%。该序列与水牛和山羊的IL-2基因序列同源性最大,在95%以上;氨基酸和抗原性比较分析显示,奶牛的IL-2与山羊及水牛的IL-2在这两方面有较高的同源性。 相似文献
3.
应用PCR技术扩增牛新孢子虫NcSRS2基因,纯化PCR产物后与克隆载体pMD18-T Simple Vector连接,将PCR、酶切鉴定及测序分析正确的pMD-18T-NcSRS2重组质粒进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,克隆至相同酶切回收后的腺病毒穿梭载体pCR259中,再将PCR、酶切鉴定正确的pCR259-NcSRS2重组质粒转染293细胞,应用IF-AT和Western-blotting技术检测重组质粒在293细胞中的表达情况。结果显示,扩增的牛新孢子虫NcSRS2基因长度为1 227bp,与GenBank中发表的NcSRS2（AF061249）核苷酸序列同源性为99%,构建的pCR259-NcSRS2重组质粒在293细胞中得到瞬时表达,表达蛋白的相对分子质量为43 000,具有较好的反应原性。本试验为新孢子虫病腺病毒载体疫苗的构建奠定了基础。 相似文献
4.
根据GenBank(D12692.1)上发表的牛瑟氏泰勒虫HSP70基因序列设计、合成1对特异性的引物,采用PCR方法扩增牛瑟氏泰勒虫HSP70基因片段,将扩增产物与pMD18-Tsimple载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序;用pGEX-4T-1表达载体构建重组质粒pGEX-HSP70,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE、Western-blot分析。结果表明:扩增的HSP70基因与D12692.1序列同源性为99.3%;表达的融合蛋白分子质量约为68ku,而且可与牛瑟氏泰勒虫阳性血清发生特异性反应。 相似文献
5.
根据GenBank中MIC3基因序列设计1对引物,采用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因片段,克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定.重组质粒pcDNA3-MIC3肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测血清特异抗体;经腹腔攻击感染弓形虫GJS株速殖子,观察小鼠的生存时间.结果成功构建了pcD-NA3-MIC3质粒;免疫组小鼠血清检测到特异性抗体;攻击感染后免疫组小鼠平均存活时间较对照组明显延长.表明该核酸疫苗具有较好的免疫原性,能诱导小鼠产生良好的免疫保护作用. 相似文献
6.
为了给猪圆环病毒病的诊断及防制提供科学依据,试验参考GenBank中猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2) ORF1基因序列,设计1对特异性引物,进行ORF1基因的PCR扩增,扩增出PCV2贵州株ORF1基因片段。扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET-30a(+)原核表达载体中,经双酶切鉴定后测序。结果表明,ORF1基因在pET-30a(+)载体中位置正确,pET30a-PCV2-ORF1原核表达质粒构建成功,转化至Rosetta菌,用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE检测,结果显示PCV2-ORF1在pET-30a(+)中获得了高效融合表达,其表达蛋白分子质量约为42 ku。重组蛋白主要以包涵体的形式表达,包涵体洗涤溶解后,采用Ni2+离子金属螯合亲和层析柱纯化蛋白,Western blotting分析结果表明,表达蛋白能和抗His标签的单克隆抗体反应。 相似文献
7.
根据GenBank上发表的羊痘病毒(CPV)P32基因序列,设计并合成一对引物,PCR扩增出837bp基因片段并克隆到pMD18-T载体中,酶切鉴定并测序。将P32基因定向克隆到pET32a表达载体中,酶切及测序鉴定正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。采用镍离子亲和树脂在变性条件下对蛋白进行纯化,Western blot证明该重组蛋白具有良好的反应原性。 相似文献
9.
棘阿米巴角膜炎的临床诊断比较困难,以角膜刮片的病原学诊断为主,样本采集困难,临床诊断率低。本研究构建了棘阿米巴原虫actin1基因进行原核表达载体,并进行鉴定。以棘阿米巴滋养体cDNA为模板,通过特异性引物,经聚合酶链反应,获得actin1基因开放阅读框(ORF)片段,进行克隆及序列分析,经双酶切,连接,构建重组表达载体pET22b(+)-actin1。将重组载体转化入大肠杆菌(E.coli)DH5α,筛选出阳性菌落,经PCR扩增和酶切鉴定后,阳性质粒送样测序;提取阳性质粒,转化入E.coli BL21(DE+),1mol/L IPTG诱导重组蛋白r-actin1的表达。自棘阿米巴滋养体cDNA扩增得到约774bp的actin1基因片段;经PCR和酶切鉴定表明,重组表达载体pET22b(+)-actin1构建成功;重组菌株BL21(DE+)/pET22b(+)-actin1,经培养、诱导、SDS-PAGE电泳,出现1条相对分子质量约为30 000重组蛋白条带,r-actin1表达诱导表达成功。成功构建重组表达载体pET22b(+)-actin1,并诱导表达。 相似文献
10.
为了实现牛支原体P33蛋白在大肠杆菌中的高效表达,试验在不改变P33蛋白氨基酸序列的情况下,根据GenBank发表的P33基因序列(登录号为AIA33909.1)设计并合成特异性引物,利用PCR法扩增P33基因,进行双酶切并将基因片段克隆到pET28a(+)载体中,构建重组质粒pET28a(+)/P33,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后进行原核表达,再利用His-tag镍柱纯化P33重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:成功扩增得到牛支原体P33基因,其核苷酸序列长度为710 bp,重组菌株在温度为30℃、以0.5 mmol/L IPTG诱导12小时时,P33蛋白表达量最高;经His-tag镍柱纯化后P33蛋白在33 ku处有明显的蛋白印迹条带,与预期大小相符。说明成功实现了在大肠杆菌中表达牛支原体P33重组蛋白。 相似文献
11.
本试验旨在扩增延边黄牛白细胞介素18(IL-18)全长cDNA,并对其序列进行进化分析。根据GenBank中已公布的牛IL-18 cDNA序列设计1对引物,利用RT-PCR从刀豆蛋白(ConA)和植物分裂素(PHA)双重刺激36 h活化的延边黄牛脾淋巴细胞中扩增出牛IL-18全长cDNA,进行PCR、酶切和测序鉴定,并做进化分析及二级结构预测。扩增出延边黄牛IL-18全长cDNA,大小为760 bp,其中有两个氨基酸突变。进化分析结果显示,延边黄牛IL-18与牛、山羊、绵羊、马和猪的同源性较高,均大于90%,与同种群牛的同源性最高,而与原鸡的同源性最低,为51.1%。本研究确定了IL-18的种群差异,并预测了二级结构特性,为进一步研究延边黄牛IL-18的基因表达、生物活性及其作为佐剂的应用奠定了基础。 相似文献
12.
为获得可用于鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体检测的重组抗原VP2蛋白,根据GenBank中发表的IBDV VP2序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术克隆IBDV经典标准攻毒株(BC6/85株)的VP2基因,插入质粒pET-32a中构建重组表达质粒pET-32a-VP2,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后,Western-blot检测表明具有良好的反应原性。本研究为下步建立IBDV抗体的间接ELISA方法及新型疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
13.
试验旨在表达牛乳头瘤病毒（BPV）的L1衣壳蛋白,并制备其多克隆抗体。对疑似牛乳头状瘤的病料进行病理组织学检查,采用L1基因简并引物FAP59/FAP64进行扩增,然后设计特异性引物,将衣壳蛋白L1基因亚克隆至pET-30a （+）表达载体中,构建重组原核表达载体pET30a-BPV2-L1,在E.coli RosettaTM（DE3） pLysS宿主菌中表达重组蛋白rBPV2-L1,并以纯化的rBPV2-L1蛋白为免疫原制备兔抗BPV2-L1蛋白多克隆抗体,随后间接ELISA检测其效价,并进行间接免疫荧光试验分析。病理组织切片观察结果显示,病变部分表皮细胞增生、角质过度并出现细胞挖空等BPV感染的组织病变情况;序列分析确定BPV分离株的基因型为2型,L1基因编码区长1 494 bp,可编码一个含有497个氨基酸的衣壳蛋白,蛋白分子质量为55.5 ku;与各型BPV的L1氨基酸序列系统进化树分析结果显示,其与BPV2-SW01（GenBank登录号：KC878306.1）、BPV2（GenBank登录号：KX113620.1）处于同一遗传进化分支,且属于Delta属成员;诱导表达的rBPV2-L1蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中;间接ELISA法检测多克隆抗体效价高达1：163 840,间接免疫荧光分析表明,兔抗BPV2-L1多克隆抗体能与瞬时表达的BPV2-L1蛋白发生特异性反应。以上结果证实,本研究成功克隆、表达了BPV2 L1基因,且重组蛋白rBPV2-L1具有较好的免疫原性,所制备的BPV2-L1蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性,为进一步研究BPV2亚单位疫苗奠定基础。 相似文献
14.
根据H9N2亚型禽流感病毒（AIV）的NS1基因序列,设计1对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增AIV的NS1基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32α（＋）中,构建重组表达质粒pET-32α（＋）-NS1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导得到NS1融合蛋白;其相对分子质量约28 000,分析显示NS1基因的原核表达载体成功构建,表达蛋白以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白,为进一步开展关于NS1蛋白的功能,为建立鉴别禽流感疫苗免疫和野毒感染ELISA诊断试剂盒奠定基础。 相似文献
15.
RAN Xu-hua CAO Si ZHANG Yao WEI Xiao-man WEN Xiao-bo NI Hong-bo ZHU Zhan-bo 《中国畜牧兽医》2015,42(5):1104-1109
Rotavirus is a major cause of acute diarrhea in both many kinds of young animals and children under 5 years old.Rotavirus NSP1, a 55 ku RNA binding protein, is the product of gene 5, which can subvert innate immune responses and be one of virulent determinant factors.According to the sequence in GenBank, specific primers targeting to NSP1 gene were designed and the gene was amplified by RT-PCR, following by being cloned into the pET-28a(+) vector.It showed that the full length of NSP1 gene was 1 473 bp, encoding 491 amino acids.The NSP1 shared the highest identity with WC3 strain.The recombinant protein was induced in E.coli Rosetta(DE3) by IPTG and was analyzed by SDS-PAGE and Western blotting.The results revealed that NSP1 recombinant protein existed in the form of inclusion body with the molecular weight of 55 ku.The purified recombinant protein could be recognized by His-tag antibody.This study laid the foundation for further research on the relationship between the intracytoplasmic location of NSP1 protein and its activity. 相似文献
16.
轮状病毒是引起多种幼龄动物及5周龄以下儿童腹泻的主要病原体。NSP1非结构蛋白是轮状病毒基因5的产物,为长约55 ku的RNA结合蛋白。现已发现NSP1蛋白是一种毒力决定因子,可颉颃宿主先天性免疫应答。参照GenBank收录的牛轮状病毒UK株序列设计并合成1对特异性引物,本试验利用RT-PCR方法扩增牛轮状病毒UK株NSP1基因,克隆入pET-28a(+)表达载体,经双酶切和测序鉴定,并利用分子生物学软件进行同源性比对分析。本试验结果显示获得的NSP1基因全长编码区序列为1 473 bp,编码491个氨基酸,与美国WC3株同源性最高。将阳性重组质粒转入E.coli Rosetta(DE3)宿主菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行分析,结果表明重组蛋白分子质量约为55 ku,以包涵体形式表达,可与鼠抗His-tag抗体反应。本试验成功获得牛轮状病毒UK株NSP1基因,且实现了在原核表达系统中高效表达重组蛋白,本试验结果为研究NSP1蛋白在细胞内定位与其活性之间的相互关系奠定了基础。 相似文献
17.
研究旨在原核表达气肿疽梭菌细胞毒素A （CctA）基因,用纯化的重组蛋白建立其间接ELISA检测方法,a。利用大肠杆菌密码子的偏爱性优化CctA基因序列,克隆至原核表达载体pET-28a （+）,双酶切鉴定原核表达质粒pET28a-CctA并测序。将重组质粒转入大肠杆菌,经IPTG诱导得到高表达的重组CctA包涵体蛋白。包涵体蛋白变性后经镍（Ni）柱纯化,SDS-PAGE检测其纯化效果。以豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清为一抗,用Western blotting方法检测重组CctA蛋白的反应原性。用棋盘滴定法建立间接ELISA检测方法,以复性后的重组CctA蛋白作为检测抗原,摸索抗原包被浓度、封闭液的种类及浓度、抗体的最适稀释度和反应条件等。选用3批气肿疽灭活疫苗免疫豚鼠后采集血清,同时用攻毒和间接ELISA两种方法验证疫苗的免疫效力。质粒双酶切结果显示,得到大小约853 bp的条带,与预期相符,且测序结果正确。SDS-PAGE结果表明,成功表达并纯化大小为35 ku的重组CctA蛋白。Western blotting结果显示,豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清与重组CctA蛋白具有良好的反应原性。建立的间接ELISA法的最适条件为：抗原的包被浓度为0.5 μg/mL,于4 ℃包被过夜;封闭液选择10%胎牛血清,37 ℃孵育2 h;二抗的稀释度为1：8 000;室温避光显色10 min后终止反应,测定D450 nm值。当P/N>4.6时,间接ELISA法检测结果与豚鼠攻毒试验结果拟合度较好。本研究成功表达CctA基因并纯化了重组CctA蛋白,建立的以重组CctA蛋白为检测抗原的间接ELISA检测方法,有望成为气肿疽灭活疫苗免疫效果验证的替代方法。 相似文献
18.
D L Godson M E Baca-Estrada A G Van Kessel H P Hughes M A Morsy J Van Donkersgoed R J Harland D E Shuster M J Daley L A Babiuk 《Canadian journal of veterinary research》1995,59(4):249-255
The acute phase response is a collection of physiologic changes initiated early in the inflammatory process. This response is comprised of both localized changes at the site of infection or injury and the initiation of systemic responses, such as the increase in production of acute phase proteins. Cytokines such as interleukin (IL)-1, IL-6, and tumor necrosis factor (TNF) play key roles in the regulation of acute phase response in the species studied to date. To better characterize the acute phase response of cattle, recombinant bovine (rBo). IL-1 beta was administered to cattle. A single administration of rBoIL-1 beta was able to induce a dose dependent increase in body temperature, circulating leukocytes, and serum haptoglobin and fibrinogen concentrations, as well as a decrease in plasma zinc concentration. Five daily administrations of rBoIL-1 beta resulted in heightened and prolonged elevations of haptoglobin and fibrinogen. In addition, alpha 1-acid glycoprotein levels were increased, a response not seen after a single administration of rBoIL-1 beta. These results indicate that IL-1 is an important regulator of the acute phase response in cattle. 相似文献
19.
[目的] 利用原核表达系统表达1型鹅星状病毒（Goose astrovirus 1,GAstV-1）结构蛋白ORF2,并制备其多克隆抗体。[方法] 根据GAstV-1 TZ03株基因序列,对ORF2基因序列进行大肠杆菌密码子偏爱性优化和合成,将其克隆至原核表达载体pET-30a（+）,构建重组质粒pET-ORF2,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;将鉴定正确的重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,以间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性。[结果] 酶切和测序结果显示,成功获得重组质粒pET-ORF2;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为70 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA检测制备的兔抗ORF2蛋白多克隆抗体效价达1：128 000;间接免疫荧光试验结果显示,制备的多克隆抗体能与GAstV-1发生特异性反应。[结论] 原核表达的GAstV-1 ORF2重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔源多克隆抗体具有较高的效价和特异性,为研制GAstV-1相关诊断试剂奠定了基础。 相似文献
20.
根据GenBank登陆的单增李斯特菌标准株EGD序列设计引物,PCR扩增LM01847基因片段后插入表达载体pET-30 a,构建重组原核表达载体,并在E. coliBL21中成功表达。纯化目的蛋白制备多抗,ELISA结果显示:该蛋白多抗与单增李斯特菌全菌、全菌多抗与该蛋白均可发生反应。证明该蛋白在天然状态下存在于单增李斯特菌表面,且具有良好的免疫反应性。该蛋白在45℃、高盐、酸性环境中表达水平基本稳定,但在低pH值条件下反应活性消失;高盐或低温条件下,表达量随盐浓度的升高或温度的下降而降低。除4℃以外,该蛋白均能保持良好的免疫反应活性。本研究为建立针对该蛋白的李斯特菌免疫微球凝集、免疫磁珠分离等检测方法奠定基础。 相似文献