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1.
构建新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)基因的原核表达载体,并将其在宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中表达。以NDV La Sota株NP基因序列为模板,设计特异性引物,通过PCR扩增获得NP蛋白全长基因片段,定向插入原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-NDV NP;将构建的重组质粒转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,表达出目的蛋白,并采用亲和层析的方法纯化表达蛋白;表达蛋白采用Western blotting方法检测其反应原性。结果显示,成功克隆了新城疫病毒NP基因全长,片段序列1470 bp;构建的pET-NDV NP载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误;转化表达宿主菌后经SDS-PAGE检测结果显示目的基因得到成功表达,且表达蛋白经Ni-NTA镍离子亲和层析法被成功纯化,蛋白质浓度为3 mg/mL;Western blotting检测结果显示表达蛋白具有良好的反应原性。试验结果表明,成功构建了含有新城疫病毒核衣壳蛋白基因的原核表达载体,成功表达、纯化得到了NDV NP蛋白。 相似文献
2.
为分析新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)及其突变体(Fm)基因的反应原性,以携带有NDV-F和NDV-Fm基因的质粒为模板设计引物,PCR扩增产物经双酶切后分别连入原核表达载体pET-SUMO、pET-28a,构建重组质粒pET-SUMO-F、pET-28a-Fm,将重组质粒转化入宿主菌Rosetta 2感受态细胞,在IPTG诱导下表达。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,NDV-F和NDV-Fm在原核系统中表达后分别获得了相对分子量为64.7 kD和48.7 kD的重组蛋白;重组蛋白能被抗NDV鸡阳性血清识别。试验表明,NDV-F和NDV-Fm可以在原核系统中表达,且具有良好的反应原性。 相似文献
3.
提取猪日本脑炎病毒(JEV)上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,RT-PCR扩增JEV的NS3基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,酶切鉴定和PCR鉴定重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3,转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组His-JEV-NS3蛋白,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达,his-band试剂盒纯化重组蛋白。获得了1.8kb NS3基因片段,成功构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3。IPTG诱导获得分子质量为64ku的His-JEV-NS3蛋白,该蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占总菌体蛋白的30%以上,纯化后获得高纯度重组蛋白,其占总蛋白比例达70%以上。 相似文献
4.
采用PCR方法从鸡源新城疫病毒（NDV）强毒F48E9株P基因重组质粒中扩增出了V基因全长cDNA，并引进相应的突变位点，将其克隆到pMD18-T载体，然后亚克隆到原核表达载体pET-30c上，重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序，筛选出阳性重组质粒，并命名为pET-30c-V。将pET-30c-V转化大肠埃希氏菌BL21（DE3），用1mmol／LIPTG 37℃过夜诱导表达，SDS-PAGE及Western-blotting分析结果表明，所表达的NDVV重组蛋白主要以包涵体形式存在，分子质量约28ku，与理论值大小相符。将包涵体用8mol／L脲变性，经Ni-NTA柱纯化，透析复性，得到纯化的V蛋白。用复性后的V蛋白免疫21日龄SPF鸡（300μg／只），成功制备了抗鸡NDVV蛋白的抗血清。 相似文献
5.
《中国兽医学报》2016,(7):1178-1182
用real-time PCR方法扩增家兔PepTⅠmRNA序列,通过原核表达体外获得家兔PepTⅠ蛋白,旨在制备多克隆抗体。试验通过RT-PCR方法成功扩增出2 001bp的家兔PepTI基因片段,设计特异性引物成功扩增出抗原表位相对集中的1 071bp大小的片段,构建重组表达质粒,获得融合蛋白。结果显示:家兔PepTⅠ基因片段成功的连接到pMD18-T载体上,重组克隆载体双酶切后回收目的片段分别连接到原核表达载体pET-32a、pET-28a,经转化提取质粒测序验证后表明,成功构建原核表达载体pET-32a-P、pET-28a-P,将重组质粒转化至感受态细胞BL21(DE3)后IPTG诱导,成功表达出PepTⅠ融合蛋白,目的蛋白相对分子质量大小约为44 000,与预期试验结果相符。结果表明:本试验成功扩增出家兔PepTⅠmRNA序列,并且通过原核表达获得家兔PepTI融合蛋白。 相似文献
6.
为了克隆和田羊肌肉生长抑制素（Myostatin）蛋白成熟肽编码基因片段,并对其进行原核表达,试验根据绵羊Myostatin蛋白成熟肽基因序列从GenBank（登录号为NM001009428）中设计并合成1对引物。以塔里木大学动物基因工程实验室构建的和田羊Myostatin基因全序列的克隆载体为模板,采用PCR方法特异性扩增和田羊Myostatin蛋白成熟肽基因片段;将其克隆到pMD18-T载体中,构建克隆质粒pMD18-T-Ms;经PCR和双酶切分析鉴定,将阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证;测序验证后双酶切pMD18-T-Ms克隆质粒和pET-28a（+）表达质粒,进一步构建pET-28a（+）-Ms重组表达质粒。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导后表达Myostatin蛋白成熟肽,通过SDS-PAGE电泳分析鉴定表达的重组蛋白。结果表明:PCR特异性扩增出1条长度约为330 bp的条带;序列测定分析显示和田羊Myostatin蛋白成熟肽基因片段长327 bp,与GenBank上绵羊Myostatin蛋白成熟肽编码基因从799～1 125 bp片段的核苷酸同源性为100%,所表达的Myostatin蛋白成熟肽分子质量约为14.7 ku。试验成功克隆和田羊Myostatin蛋白成熟肽编码基因片段,构建了其克隆质粒pMD18-T-Ms和重组表达质粒pET-28a（+）-Ms,并在大肠杆菌中获得有效表达。 相似文献
7.
为获得狂犬病病毒（RV）糖蛋白抗原，采用RT-PCR方法从狂犬病病毒ERA株中扩增了编码RV糖蛋白的全长基因，将其克隆于pMD18-T载体，再经PCR扩增出糖蛋白全长基因和膜外区基因，将其分别亚克隆至原核表达载体pET-28a（＋）、pET-32a（＋）和pGEX-4T-1中，经PCR和双酶切鉴定以及序列分析，表明已成功构建了重组质粒。将重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21（DE3）中进行表达，结果显示，克隆到pET-32a（＋）的糖蛋白膜外区基因表达量最高，目的蛋白表达量占菌体总蛋白的45．4％。经Western-blotting检测，不同载体表达的糖蛋白膜外区产物均可与兔抗RV多抗发生特异性反应，表明，重组蛋白具有良好的反应原性。 相似文献
8.
《畜牧与兽医》2017,(9):67-70
根据禽网状内皮组织增生症病毒(REV)DBYR1102株的前病毒基因组c DNA序列设计并合成1对引物,以p T-G质粒为模板,通过PCR扩增获得该病毒CA基因片段。将其克隆于pET-30a(+)中,构建原核表达质粒pET30a-CA。重组质粒经双酶切和测序鉴定,转化BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。利用Ni-NTA His Bind Resin纯化重组蛋白,并经蔗糖浓缩,Western blot法检测重组蛋白的反应原性。纯化后的目的蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗CA多克隆抗体并对其进行鉴定。结果表明构建的重组质粒pET-30a-CA在大肠杆菌BL21中呈可溶性高效表达。经Ni柱纯化和蔗糖浓缩后得到纯度较高的融合蛋白,以纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,抗体效价达1∶25 600。该研究为REV的检测及CA基因的深入研究奠定了基础。 相似文献
9.
利用PCR技术从弓形虫RH株基因组中扩增出Rop18基因片段,克隆入pET-30a载体,将重组质粒转化入大肠杆菌Top10中,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列(登录号:JX045329.1)比对发现,核苷酸同源性为99.6%。将阳性重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,表达产物经SDS-PAGE检测结果显示,Rop18基因在大肠杆菌中成功表达;融合蛋白的分子质量在66.2 ku左右,Western blotting显示其能被兔抗弓形虫免疫血清识别。结果表明,弓形虫RH株Rop18基因可以在原核表达系统中高效表达,该重组蛋白具有免疫原性,有望作为弓形虫疫苗候选抗原。 相似文献
10.
将新城疫病毒（NDV）F48E9株的M、NP、F和HN基因克隆到真核细胞表达载体pCAGG上，经酶切、PCR鉴定和序列分析，分别筛选出了含有M、NP、F和HN基因的重组质粒，命名为pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGGHN。纯化后的重组质粒通过脂质体单独转染HeLa细胞，经间接免疫荧光试验检测到了M、NP、F和HN蛋白的表达。pCAGGM、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG—HN重组质粒组合共转染HeLa细胞48h后，可以观察到明显的细胞融合现象。试验结果表明，NDVF48E9株的M、NP、F和HN蛋白均在HeLa细胞内得到了成功表达，同时证明在该表达系统中F蛋白不足以诱导细胞融合。 相似文献
11.
鸡柔嫩艾美尔球虫ZJ株3-1E基因的原核表达及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
本实验对E．tenellaZJ株的3-1E基因进行了克隆和表达。根据已报道的柔嫩艾美尔球虫3-1E基因序列设计引物,以孢子化卵囊总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增得到一条特异片段,将扩增产物克隆至pUCM—T,转化感受态菌DH5仅,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列比较,核苷酸同源性为99．5％。然后将重组质粒和表达载体pET-30a分别以EcoRⅠ、SalⅠ酶切后构建重组表达载体pET-30a-3—1E,并将其转化入大肠杆菌BL21中,提取质粒经酶切和PCR鉴定正确后,用IPTG诱导表达。表达产物经SDS—PAGE和Westernblot检测显示,3-1E基因在大肠杆菌中成功表达;融合蛋白的分子量约为27ku,诱导6h的蛋白表达量可达到47、024％。 相似文献
12.
新城疫病毒(NDV)的V蛋白是一种干扰素拮抗蛋白,该蛋白表达量的差异对NDV细胞嗜性的影响是目前的热点问题.为制备NDV V蛋白多克隆抗体,本研究以Class Ⅰ NDV 9a5b株和Class Ⅱ NDV ZJl P基因为模板扩增V蛋白PNT结构域和V蛋白半胱氨酸富集区(CTD)结构域,分别克隆至pET-28a(+)载体和pCold TF载体中,获得表达V蛋白或其CTD结构域的重组表达质粒.将重组质粒转化大肠杆菌诱导表达;纯化重组蛋白,并分别免疫小鼠,制备针对Class Ⅰ和ClassⅡNDV V蛋白的多克隆抗体.利用该多克隆抗体,western blot检测NDV 9a5b、La Sota、ZJ1、Herts/33株感染HeLa和DF1细胞后V蛋白的表达量变化.结果显示制备的多克隆抗体可以用于NDV V蛋白的检测,V蛋白在易感宿主禽源细胞中的表达量明显高于哺乳动物细胞.研究表明NDVV蛋白的表达水平与宿主细胞的种属差异相关. 相似文献
13.
将新城疫病毒（NDV）F48E9株的F和HN基因克隆到真核细胞表达载体pCAGG上,经酶切、PCR鉴定和序列分析,筛选出含有F和HN基因的重组质粒,命名为pCAGG-F和pCAGG-HN。纯化的质粒转染Vero细胞后,经间接免疫荧光试验检测到蛋白的表达。pCAGG-F和pCAGG-HN重组质粒共转染Vero细胞后,观察到明显的细胞融合现象。结果表明NDV F48E9株的F和HN蛋白在真核细胞内得到了真实的表达,并且表达产物具有天然蛋白活性。 相似文献
14.
为研究引起奶牛乳房炎的病原菌停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌的gapC基因工程疫苗及其生物免疫活性,试验采用PCR方法扩增出停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌的gapC基因cDNA序列,克隆到pMD18-T载体上,将重组质粒pMD18-T-TRgapC、pMD18-T-WRgapC和pMD18-T-RFgapC经双酶切鉴定、测序及序列分析后,再将gapC基因亚克隆到pET-28a(+)原核表达载体上,构建停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌的gapC基因原核表达质粒pET-28-TRgapC、pET-28-WRgapC和pET-28-RFgapC;将构建好的原核表达质粒转化至宿主菌BL21(DH3)中,诱导表达目的蛋白。表达产物经SDS-PAGE电泳、纯化、复性后经Western blot检测,得到了约38 ku的条带,与预期大小相符。说明这3种蛋白有一定的免疫原性。 相似文献
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新城疫病毒F基因在大肠埃希菌中的表达及其抗原性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
构建新城疫病毒融合蛋白F基因的原核表达载体,并将其在宿主菌BL21(DE3)感受细胞中表达.以含有融合蛋白F基因的重组质粒pMD19T-F为模板,设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得F基因的F1片段,定向插入原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-F1,将构建成功的重组质粒pET-F1转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导,将其在宿主菌细胞中表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot方法检测.结果显示,成功克隆出了新城疫病毒F1基因片段序列852 bp.构建的pET-F1载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误,转化表达宿主菌后经SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,目的基因被成功表达,并具有良好的反应原性.成功构建了新城疫病毒的融合蛋白F基因原核表达载体,转化宿主细胞后成功表达了融合蛋白F1重组蛋白片段. 相似文献
17.
《中国兽医学报》2020,(6)
试验旨在表达、纯化扩展莫尼茨绦虫VASA蛋白,并制备兔抗VASA多克隆抗体。根据扩展莫尼茨绦虫全基因核苷酸序列设计特异性引物,利用PCR方法扩增vasa基因片段;将扩增产物与原核表达载体pET-22b(+)连接,获得重组质粒pET-22b-VASA;经Amp抗性筛选阳性菌,双酶切、PCR测序鉴定后,将其转化大肠杆菌(DE3)感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达;重组融合蛋白经镍柱纯化后,进行Western blot鉴定;将融合蛋白免疫兔,制备多克隆抗体。结果显示,重组质粒pET-22b-VASA构建正确,通过IPTG诱导获得大小约32 200的VASA重组融合蛋白;Western blot分析表明其与鼠抗His单克隆抗体呈阳性反应。纯化的VASA蛋白免疫兔获得了多克隆抗体,ELISA检测其效价为1∶128 000。本试验成功制备了具有免疫原性的VASA蛋白及其兔源多克隆抗体,为VASA蛋白生物学功能及该蛋白在绦虫体内的分布等研究奠定基础。 相似文献
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根据鼠脱氧核糖核酸酶Ⅱ (DNase Ⅱ)基因设计引物,通过RT-PCR 扩增出鼠DNase Ⅱα基因片段,克隆到pMD-18T载体,然后转化至大肠杆菌JM109.经鉴定及序列测定,克隆基因与鼠DNase Ⅱα基因序列完全一致,大小为1 008 bp.将重组质粒pMD-DNase Ⅱα进行酶切后连接到原核表达载体pET-28a中,重组质粒经PCR和双酶切鉴定及序列分析正确后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测,然后进行初步纯化,Western-blot鉴定.结果表明,本试验成功构建了pET-28a-DNase Ⅱα表达载体;表达产物以包涵体形式存在,相对分子质量约为38 800;初步纯化的目的蛋白在SDS-PAGE图谱上呈单一条带,Western-blot鉴定能与抗体发生特异免疫反应. 相似文献
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为构建牛分支杆菌ag85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出ag85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒。将此重组质粒转化入大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定。酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同。结果表明,成功地克隆并构建了ag85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b。 相似文献