共查询到17条相似文献，搜索用时 343 毫秒
1.
为了阐明我国马传染性贫血病毒(EIAV)弱毒疫苗致弱及免疫保护的分子机制,本研究分析了疫苗株及其亲本强毒株共34个囊膜基因序列.结果发现疫苗株在膜基因gp90 V4区潜在的N-连接糖基化位点出现了稳定的碱基替换,使该位点消失.为研究囊膜糖基化的作用,以疫苗株全长感染性克隆pLGFD3-8为亲本,利用反向遗传技术对该突变位点进行了糖基化序列回复突变操作,构建了全基因感染性克隆pLGFDg9.将其转染驴胎皮肤细胞(FDD).通过用逆转录酶活性、间接免疫荧光和RT-PCR方法检测而确定其感染性.结果表明,在FDD细胞中盲传3代后,在细胞培养物中可检测到逆转录酶活性,RT-PCR和间接免疫荧光检测均呈阳性,电镜下见到典型的EIAV颗粒. 相似文献
2.
为研究EIAV弱毒疫苗株(EIAV_(FCCV15))S2基因发生的稳定性突变对疫苗株特性的作用以及S2基因的功能,以EIAVFDDVl5感染性克隆质粒pFDDV3-8为模板,根据疫苗研制过程中S2基因发生的4个主要稳定性变异位点,构建及拯救出S2基因不同差异位点逆向突变为强毒株相应氨基酸的6株感染性克隆衍生毒株.经实时定量PCR、逆转录酶活性和western blot等检测表明,疫苗株S2基因4个稳定性变异位点全部逆向突变的感染性克隆衍生毒、,pFDDVS2rl-3-4-5在体外培养靶细胞中的复制水平低于亲本疫苗株感染性克隆衍生病毒和其他组合的逆向突变的感染性克隆衍生病毒,提示ELAV疫苗株S2蛋白4个稳定突变位点的综合作用可能是决定疫苗株和强毒株特性差异的因素之一.以上结果为体内感染S2基因逆向突变感染性克隆衍生病毒,进一步揭示S2基因在ELAV弱毒疫苗致弱过程中的作用提供了依据. 相似文献
3.
马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus,EIAV）长末端重复序列（Long terminal repeat,LTR）是基因组中高度变异区之一,EIAV LTR的变异对于指导病毒的复制和病毒致病性具有重要的生物学意义。为了阐明我国马传染性贫血病毒弱毒疫苗毒力致弱的分子机制,由马传贫强毒至弱毒致弱过程中不同代次毒株LTR序列的分析,以驴胎皮肤弱毒株疫苗全长感染性克隆pLGFD3-8为父本,选取LTR R区的TAR起始碱基,poly（A）附加位点,采用反向遗传操作对其位点进行PCR体外定点突变,将弱毒序列构建的逆向点突变型全基因克隆转染到驴胎皮肤细胞（FDD）并在FDD上传代,通过逆转录酶活性（RT）检测、RT-PCR方法及real-time RT PCR检测并验证其感染性。检测结果为构建的逆向点突变型感染性克隆在FDD上被拯救,其衍生病毒感染的FDD上出现明显的细胞病变;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT-PCR阳性;电镜下可见大量典型的EIAV颗粒pLGFD-M点突变型嵌合克隆衍生病毒与其父本克隆衍生病毒pLGFD3-8复制水平相似。此结果为进一步深入研究LTR对马传染性贫血病毒复制水平和毒力的影响奠定了基础。 相似文献
4.
为研制马传染性贫血病毒(EIAV)标记疫苗株,本研究在EIAV驴胎皮肤(FDD)细胞弱毒疫苗株感染性克隆pEIAVFDDV3-8的S2基因内部引入两个终止密码子,致使S2基因终止表达,构建了一株S2基因突变的感染性克隆pEIAVFDDV3-8△S2。用该重组质粒转染FDD细胞,盲传至第4代时,转染细胞病变明显,电镜下可见细胞内的典型病毒颗粒。反转录酶活性检测和Real-time PCR对病毒拷贝数的检测均证明,获得了EIAVS2基因终止表达的感染性克隆毒株,命名为EIAVFDDV3-8△S2。 相似文献
5.
分别以EIAV辽宁马强毒株（EIAVliao）前病毒DNA和马传染性贫血驴白细胞弱毒疫苗株（EIAVDLV）前病毒DNA为模板,从免疫接种后不同时期马血清中利用nested—PCR技术,扩增了约1．4kb的gp90基因。将其克隆后进行了测序,测序结果表明,免疫EIAVDLV后的第1时期至第5时期,与EIAV—liao比较核苷酸序列平均差异率分别为3．2956％、3．1456oA、3．36％、3．1856％和3．6456％。EIAVliao有20个N-连接糖基化位点,EIAVDLV平均是17．2个,其中有11个N-连接糖基化位点是高度保守的。 相似文献
6.
马传染性贫血病毒(EIAV)减毒疫苗是世界首例慢病毒疫苗,但其作用机理尚不明了。我们的前期研究发现EIAV疫苗株EIAVFDDV12编码跨膜蛋白gp45的基因在马体内发生高频率G2230A点突变形成终止子,使该蛋白C末端出现154个氨基酸的截短。为了探讨该截短蛋白对EIAV疫苗株生物学特性的作用,本研究以EIAV弱毒疫苗株感染性克隆基础上,构建了gp45截短型感染性克隆,脂质体转染细胞,增殖传代,获得病毒株EIAVFDDVTM-36,接种到马体内。在接种后167 d内未观察到临床症状,连续注射10 d地塞米松以暂时抑制免疫系统,并用迟发性超敏反应和淋巴细胞增殖实验评价免疫抑制效果。结果显示,截短型跨膜蛋白疫苗株EIAVFDDVTM-36接种组免疫抑制前后病毒载量和中和抗体效价差异不显著,而完整型跨膜蛋白疫苗株感染性克隆EIAVFDDVTM-45接种组4匹马中3匹免疫抑制后病毒载量显著上升,同时组内中和抗体效价明显提高。以上结果表明,马体特异性免疫压力对EIAVFDDVTM-36复制无影响,而对亲本株EIAVFDDVTM-45复制有抑制,显示跨膜蛋白截短型EIAV作为疫苗更为安全。但免疫抑制造成的gp45跨膜蛋白未截短型疫苗株感染性克隆体内病毒载量升高,可以促使机体产生更高的中和抗体效价,提示该疫苗的安全性和有效性在一定程度内呈负相关(相互制约)。因此,安全性和有效性的平衡是慢病毒减毒疫苗研发需注意的重要因素。 相似文献
7.
在马传染性贫血病毒(EIAV)基因转移载体成功构建并优化的基础上,构建了EIAV基因转移载体包装盒表达重组质粒.分别根据EIAV驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株感染性分子克隆(pLGFD3-8)和驴白细胞弱毒疫苗株感染性分子克隆pOK8266T序列,设计并合成引物,扩增EIAV gag/pol全基因和rev基因的第2个外显子,分别插入真核表达载体pCDNA3.1(+),获得表达载体pCDFGP和pCDREV,与亲本株的核苷酸同源性分别是99.6%和99.8%, 编码蛋白Gag、Pol及Rcv蛋白的推测氨基酸同源性分别为99.2%、98.3%和100%.利用脂质体法,分别将pCDFGP和pCDREV单独及共转染HEK293细胞,利用EIAV阳性血清分另7进行间接免疫荧光抗体试验OVA)和蛋白免疫印迹试验(western blot),检测外源蛋白的表达情况.结果表明,双质粒共转染的细胞中转染后48 h可检测到特异性荧光,转染后60 h的细胞裂解产物中可以检测到55 ku的Gag蛋白及26 ku的p26蛋白,而单独转染pCDFGP和pCDREV的细胞,IFA和western blot试验结果均为阴性.结果表明同时存在gag/pot和rev 基因第4外显子的情况下,EIAV包装盒才能表达. 相似文献
8.
为进一步研究马传染性贫血病毒(EIAV)弱毒疫苗的减毒机制,本实验对EIAV弱毒疫苗的原始种毒EIAVLN40、亲本病毒株EIAVDV、驴白细胞弱毒疫苗EIAVDLV121和EIAVDV减毒过程中的3个中间代次病毒(EIAVDLV32、EIAVDLV62和EIAVDLV92)的gp90基因进行测序分析。结果显示,适应白细胞培养的病毒株的进化距离更接近,与亲本病毒株处于进化树的不同分支。与强毒株相比,适应白细胞培养的病毒株在9个位点发生优势氨基酸的转换和V3区糖基化位点191NSSN194的缺失。此外,伴随EIAV毒力减弱的过程,有8个位点出现优势氨基酸残基的转换,在各代次病毒株中V4区具有糖基化位点237NNTW240和246NETW249的克隆所占的比例逐渐降低,其中EIAVDLV121的糖基化位点237NNTW240完全缺失。 相似文献
9.
将来源于马传染性贫血病毒（EIAV）强毒株第25代和第118代病毒的LTR，白细胞弱毒（EIAV-DLA）的LTR，以及TAR起始碱基和／或poly（A）附加位点发生突变的驴胎皮肤细胞弱毒（EIAV—FDD）的LTR分别克隆到pCAT3-Basic质粒中，获得了6个重组质粒pCAT-25、pCAT-118、pCAT—FD、pCAT—G219A、pCAT—A294C和pCAT—G219A—A294C。同时用pcDNA3．1（＋）构建了EIAV反式激活蛋白（Tat）基因的重组真核表达质粒pcTM7-D。将pcTM7-D分别与含有不同LTR的重组质粒共转染驴胎皮肤细胞，考察Tat对LTR启动子活性的增强作用。结果表明，在皮肤细胞中Tat蛋白可以特异性增强来源于皮肤细胞弱毒疫苗株LTR的启动子活性，而对白细胞源的LTR无明显增强作用；TAR起始位点和poly（A）的单碱基突变和联合突变对Tat的反式激活作用并无明显影响。 相似文献
10.
我国从20世纪70年代开始使用EIAV弱毒疫苗后,在全国范围内基本控制了马传贫的发生,我们从现地少数EIAV琼扩阳性马外周血中扩增并克隆了二株EIAV前病毒5'LTR序列,并与国内外毒株5'LTR序列进行了比较分析,发现中国EIAV LTR特有的特异性细胞转录因子结合基序,同时发现PEA2位点不是强毒特有的基序,在弱毒中亦发现该基序. 相似文献
11.
马传染性贫血病毒疫苗致弱过程中不同代次毒株LTR序列变异 总被引：2，自引：2，他引：2
有研究认为病毒基因组长末端重复序列LTR与病毒的毒力和复制能力直接相关.中国马传染性贫血弱毒疫苗是由一株高致病力毒株经体外白细胞传代而致弱的疫苗.经过体外超过110代传代后,病毒丧失了对马高致死性毒力并保持了良好的免疫原性.本文对传代过程中的不同代次病毒基因LTR进行了克隆和序列测定,发现传代过程中LTR发生了一系列明确的变异,一是转录起始位点在64代之前均以GGAC为特征,64代之后则表现为不规律的GAAC,AAAC,AGAC或GGTC;二是TAR起始碱基在59代之前多数为A,而64代之后均为G;三是在45代之后(55代除外),poly(A)附加位点一致表现为AA,这种一致的核苷酸变化均发生在毒力明显降低的代次,提示这些突变引起的位点或结构变化很可能与病毒毒力减弱有直接关系. 相似文献
12.
马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)的密码子使用频率与哺乳动物间存在着明显差异。为此,对马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株(DLA-EIAV)囊膜全长基因按照哺乳动物优势密码子的使用原则进行了重新设计和合成,并以此为基础通过重叠延伸PCR、限制酶切等方法得到结合型和分泌型囊膜基因,将其插入含有鸡beta-actin/兔beta-globin复合启动子(AG)的高效表达载体pCAGGS中,构建了EIAV驴白细胞弱毒疫苗株结合型和分泌型囊膜基因的DNA疫苗质粒pCAGGS-opti-bou-env、pCAGGS- opti-sec-env。将构建的质粒纯化后分别转染293T细胞,以间接免疫荧光和Western blot方法检测转染48 h后细胞及上清中囊膜蛋白的表达。结果显示,两种表达质粒均可正确表达EIAV囊膜蛋白,与相对应未优化的表达载体pCAGGS-wt-bou-env和pCAGGS-wt-sec—env相比,密码子优化的基因体外瞬时表达水平有极为显著的提高,而且蛋白表达部位也与预期的结果符合。这一结果为EIAV囊膜蛋白的单抗制备、表位鉴定、免疫试验、新疫苗的开发等奠定了基础。 相似文献
13.
14.
马传染性贫血(EIA)弱毒疫苗的广泛使用存在野毒和疫苗毒鉴别困难的问题.本研究以已构建的马传染性贫血驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆(pOK8266)为基础,在其S2基因内引入NspV酶切位点,将人工合成的编码6个组氨酸的寡核苷酸插入NspV位点,获得带有组氨酸标签的重组质粒pOK8266-HIS.将pOK8266-HIS转染驴白细胞,将驴白细胞转染产物传至第6代时,在电镜下观察到了典型的马传染性贫血病毒粒子.提取pOK8266-HIS衍生病毒的前病毒基因组DNA,通过PCR扩增和测序表明,衍生病毒基因组中引入了6个组氨酸标签,从而获得了带有分子标志的马传染性贫血弱毒疫苗株,为野毒株和疫苗病毒的鉴别诊断奠定了基础.本研究还证明了S2基因中的插入突变并不影响马传染性贫血病毒的体外复制. 相似文献
15.
利用Real-time PCR和Real-time RT-PCR方法对马传染性贫血病(EIA)驴白细胞弱毒疫苗(DLA-EIAV)、DLA-EIAV感染性分子克隆衍生毒(vOK8226)、强弱毒嵌合病毒(vOKVltr)以及EIA强毒接种马后不同时期外周血白细胞中前病毒含量及血浆中病毒含量进行了监测,结果发现直接攻击强毒的2匹马及1匹接种vOK8226后再用强毒攻击的马血浆中病毒含量快速升高,伴随着明显的临床反应,最后均以死亡结束.其它免疫接种马在攻击强毒后均获得保护,没有发病,马血浆中有低水平病毒存在,攻毒后3个月血浆中检测不到病毒,说明感染马体内病毒的大量增殖与疾病的进程有着直接的关系.而外周血白细胞中前病毒的含量在各试验马各时期均能检测到,说明EIAV以前病毒的形式潜伏在感染马体内,疫苗的免疫只能控制发病,而不能清除感染的病毒. 相似文献
16.
目的：构建新型的马传染性贫血病毒（EIAV）的候选疫苗。方法：利用BAC-To-BAC杆状病毒表达系统,将中国马传贫驴白细胞弱毒疫苗（EIAVDLV）及其亲本株（EIAVLN）env基因导入到杆状病毒基因组中。转染昆虫细胞后,得到的重组病毒用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物。以本实验室构建的含有EIAVEnv基因的重组痘苗病毒,单独或与重组杆状病毒表达的EIAVEnv蛋白联合免疫小鼠。结果：构建的重组杆状病毒能正确表达全长Env蛋白。与单独免疫组相比,联合免疫组免疫应答显著增强,其中中和抗体的滴度提高5—9倍。结论：含有EIAVEnv基因的重组痘苗病毒与Env蛋白抗原联合务埔．能够诱导高滴座的中和抗体． 相似文献
17.
采用ＰＣＲ方法分三段扩增出马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株（ＥＬＡＶ ＤＬＡ）的前病毒ＤＮＡ,这三个片段覆盖马传染性贫血病毒的全部基因组,ＰＣＲ产物经克隆后顺次连接,获得一个含有ＥＬＡＶ全基因（８．０Ｋｂ）的重组质粒,将其命名为ｐ８．０。将此８．０Ｋｂ ＥＩＡＶ全基因再亚克隆到含有一完整 ＥＩＡＶ ＤＬＡ株长末端重复序列的质粒中,获得一含有 ＥＩＡＶ驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒,将其命名为ｐ８．２,经核苷酸序列分析,证明ｐ８．２含有ＥＩＡＶ前病毒的全基因。用ｐ８．２转染驴白细胞,将其作为种毒进行传代,于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测出了反转录酶,说明在驴白细胞中由ｐ８．２衍生出了ＥＩＡ病毒。驴白细胞经该克隆毒感染后,第４天出现病变,经透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子,进一步证明ｐ８．２具有感染性,我们获得了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆,为进一步在分子水平上阐明我国ＥＩＡＶ疫苗株的减毒机理和免疫保护机制奠定了基础。 相似文献