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1.
《江苏农业学报》2014,(1)
为了构建猪输血传播病毒2型(TTV2)ORF1基因部分片段的原核表达载体,进行原核表达,并利用重组蛋白质制备猪TTV2的多克隆抗体,采用PCR方法扩增出猪TTV2 ORF1基因的部分片段,将其克隆至原核表达载体pcoldI中,构建原核表达质粒pcold-g1,然后转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达。表达产物通过镍离子亲和层析柱进行纯化,用Western blot进行鉴定。将纯化的重组蛋白质免疫新西兰大白兔制备猪TTV2多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性,间接ELISA检测抗体效价。PCR扩增获得大小为1 227 bp的片段,重组表达质粒经双酶切及测序证实构建正确;重组蛋白质分子量为5.2×104,主要以包涵体形式存在,纯化后纯度可达95%以上,具有较好的抗原性;制备的多克隆抗体特异性高,抗体效价达1∶12 800。重组蛋白质在大肠杆菌中得到了高效表达,为建立TTV2间接ELISA检测方法提供了优质的包被抗原。 相似文献
2.
试验旨在制备原核表达鹅源新城疫病毒(NDV)JS/5/05/Go株M蛋白的多克隆抗体并进行鉴定。以鹅源NDV总RNA为模板,RT-PCR扩增M基因,亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)获得重组质粒pET32a-M,转化E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测表达产物;用KCl染色切胶纯化法纯化重组蛋白;采用切胶免疫小鼠的方法制备M蛋白多克隆抗体,抗体效价用间接ELISA检测,特异性用Western blot和间接免疫荧光法鉴定。结果表明,在大肠杆菌中成功表达了分子量约为55 000的重组蛋白,用切胶纯化法获得了纯度较高的重组蛋白;ELISA法检测抗体效价可达1∶102 400,Western blot和间接免疫荧光试验结果表明制备的多克隆抗体能够特异性识别纯化的M蛋白及NDV自身表达的M蛋白。 相似文献
3.
【目的】克隆猪Jiv蛋白核心区的2 112bp的基因片段,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达和纯化,制备抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。【方法】利用RT-PCR方法,从猪脾脏组织RNA中扩增得到猪Jiv基因,将其克隆到pMD19-T载体并测序,以此为基础构建原核表达载体pET32a-Jiv,转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,利用IPTG诱导表达,获得大量包涵体形式的猪Jiv融合蛋白。通过镍离子螯合层析柱对表达的目的蛋白进行纯化,对纯化后的包涵体蛋白进行透析复性,以每只新西兰白兔400μg蛋白的初次免疫剂量和500μg蛋白的加强免疫剂量进行免疫,共免疫5次,采集血清,采用间接ELISA法检测抗体效价达到一定水平后,收集抗体,利用Western blot检测抗体特异性。【结果】克隆得到长度为2 112bp的猪Jiv基因片段;构建的pET32a-Jiv在E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中经诱导后高效表达,SDS-PAGE结果显示,纯化得到分子质量约为95ku的猪Jiv融合蛋白;测得的猪Jiv蛋白多克隆抗体效价达1∶6 400;Western blot检测结果证实,所获得抗体能够有效地应用于猪Jiv蛋白抗原的检测。【结论】成功地克隆了猪Jiv基因,制备了抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。 相似文献
4.
利用大肠杆菌原核表达系统对猪整合素αv基因片段进行表达,纯化目的蛋白免疫小鼠,制备猪整合素αv多克隆抗体,并对其进行鉴定及初步应用。对基因序列进行预测分析后,截取胞外区抗原性较好的基因片段,针对大肠杆菌稀有密码子优化后合成该基因序列,克隆至pGEX-6p-1原核表达载体上,诱导表达并纯化重组蛋白,对重组蛋白进行Western blot鉴定后免疫小鼠,制备多克隆抗体。利用间接ELISIA方法检测抗体效价,利用Western blot技术检测猪整合素αv多克隆抗体与天然整合素αv蛋白的反应原性。获得了分子质量为83 ku的重组蛋白,以纯化的重组蛋白作为免疫原制备的多克隆抗体效价大于1∶6 400,且能识别天然整合素αv蛋白。研究成功制备了猪整合素αv多克隆抗体,为后续相关研究提供基础。 相似文献
5.
口蹄疫病毒非结构蛋白3D原核表达、纯化和反应原性分析 总被引：1，自引：1，他引：0
采用RT-PCR技术扩增获得口蹄疫病毒(FMDV)细胞毒O/Akesu/58的非结构蛋白3D(NSP 3D)基因编码区,并定向克隆到pProexHTb原核表达载体上,再将重组pProex-3D转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达产物用亲和层析法纯化,经SDS-PAGE鉴定和Western-blot分析抗原性;以纯化的表达蛋白免疫豚鼠制备其多克隆抗体,ELISA测定抗体效价,间接免疫荧光法检测制备的豚鼠抗NSP 3D多克隆抗体与细胞毒天然抗原的反应原性.结果表明:表达的目的蛋白大小为53ku左右;ELISA结果表明,制备的多克隆抗体效价达1∶1 024以上;Western-blot分析表明,纯化后的蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应;间接免疫荧光检测发现,豚鼠抗3D蛋白多克隆抗体可与细胞毒天然抗原反应,与阴性对照未见反应. 相似文献
6.
[目的]比较以原核表达蛋白与纯化病毒制备单克隆抗体的特性。[方法]RT-PCR扩增IBDVVP2基因,通过原核表达系统表达目的蛋白,并亲和纯化重组蛋白。尿囊液扩增IBDV,并通过超速离心纯化病毒。分别用纯化的重组VP2蛋白和IBDV免疫Balb/c小鼠,ELISA筛选杂交瘤细胞株。[结果]获得了2株分泌VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,腹水ELISA效价均为1∶2×104;4株分泌IBDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,腹水ELISA效价分别为1∶2×106,1∶6×104,1∶1×105,1∶4×103。所有单克隆抗体均与其制备用免疫原反应,不与空载体或其他病毒抗原反应。经10～20次传代,仍保持稳定的效价。[结论]纯化的原核表达VP2蛋白和IBDV均能诱导小鼠产生免疫应答;用原核表达的VP2蛋白作为免疫原,可以获得特异的VP2抗体。 相似文献
7.
【目的】制备猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白及其多克隆抗体,建立检测PDCoV N蛋白抗体的间接ELISA方法。【方法】从PDCoV CH-01毒株中扩增N全基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-PDCoV-N,转入BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组N蛋白,并对该蛋白的反应原性进行鉴定。诱导表达的N蛋白经镍柱纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。同时用镍柱纯化后的N蛋白作为包被抗原,建立PDCoV的间接ELISA检测方法,对该方法的特异性、重复性和稳定性进行检测,并利用该方法对河南部分地区猪场送检的165份临床猪血清样本进行PDCoV抗体检测。【结果】成功克隆了1 026 bp的N基因,构建了重组表达载体pET-28a-PDCoV-N,经诱导表达后获得了重组N蛋白,其相对分子质量约42.9 ku,Western blot分析表明所表达的蛋白可与抗PDCoV全病毒猪阳性血清发生反应。制备的PDCoV N蛋白多克隆抗体经Western blot检测表明,该抗体具有特异性;间接免疫荧光试验测定该多克隆抗体在ST细胞上的最佳使用稀释度为1∶200。以N蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法,确定最佳的反应条件如下:抗原2μg/mL在4℃过夜包被,10 g/L BSA在37℃下封闭2 h,血清(1∶80稀释)37℃孵育1 h,酶标二抗(1∶6 000稀释)37℃孵育1 h,TMB在37℃下显色15 min;待检血清OD_(450)值≥0.272判定为阳性。特异性试验结果显示,该包被抗原与其他猪常见病毒的阳性血清均无交叉反应,批内和批间重复试验变异系数均小于5%。用间接ELISA法对来自河南不同地区的165份血清样本进行检测,结果表明各地样本PDCoV抗体阳性率平均为53.94%。【结论】成功表达了PDCoV N蛋白,制备了其多克隆抗体,建立了PDCoV间接ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,可用于临床猪血清中PDCoV抗体的检测。 相似文献
8.
《江苏农业学报》2016,(3)
为探讨以霍乱毒素B亚单位为载体制备口蹄疫亚单位疫苗的可行性,利用E.coli表达CTB-GHloop嵌合基因,用SDS-PAGE分析目的基因的表达及表达产物的可溶性,利用神经节苷脂(GM1)为抗原鉴定重组蛋白五聚体的形成。将目的蛋白浓度调整为200μg/ml,以白油佐剂乳化制备疫苗,免疫健康仔猪,免疫后利用ELISA测定特异性抗体水平,评价免疫后体液免疫反应,利用淋巴细胞增殖实验评价细胞免疫水平。结果表明嵌合基因在E.coli中获得高效表达,重组蛋白可溶,并能够形成五聚体;Western-blot结果显示重组蛋白能够与口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清发生反应;以每头仔猪200μg免疫,试验猪产生较高的抗体水平与细胞免疫反应。 相似文献
9.
《江苏农业学报》2017,(2)
探讨原核表达的重组脑膜炎球菌外膜蛋白PorB对猪伪狂犬弱毒活疫苗免疫的增强效果。将Gen Bank公布的脑膜炎球菌外膜蛋白PorB基因克隆到原核表达载体pQZⅢ中,命名为pQZ-PorB质粒,转入大肠杆菌BL21中表达重组蛋白。采用SDS-PAGE、Western-blot技术和Ni~(2+)-NTA柱鉴定并纯化重组蛋白。将每份含100μg剂量的重组PorB蛋白与猪伪狂犬弱毒疫苗混合后分别滴鼻免疫3日龄仔猪和肌肉注射免疫50日龄猪,同时设PBS对照组和免疫前对照组。免疫28 d后测定IgG和IgA抗体水平、猪外周血淋巴细胞增殖情况以及细胞因子(IFN-γ、IL-10、IL-6)的表达水平。SDS-PAGE和Western-blot结果表明,PorB基因在大肠杆菌中表达,表达的重组PorB蛋白是可溶性的,Ni~(2+)-NTA柱能够有效纯化重组蛋白。重组PorB蛋白不但能够刺激免疫猪在较短时间内产生的较高血清IgG抗体、黏膜IgA抗体和中和抗体,而且可以通过诱导机体产生IFN-γ和IL-6来促进细胞免疫反应。在猪伪狂犬弱毒疫苗免疫中,重组PorB蛋白可以作为一种优良的免疫增强剂。 相似文献
10.
应用RT-PCR方法从三元猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素-18成熟蛋白(pmIL-18)基因,经克隆测序表明,pmIL-18基因长474bp,编码157个氨基酸。序列分析发现,与已发表的pmIL-18基因序列同源性很高,均为99%以上。将pmIL-18基因插入表达载体pcDNA3.1,成功构建了pmIL-18基因的重组真核表达载体pcD-NA3/pmIL-18。将重组质粒转染COS7细胞,经SDS-PAGE及Western-blotting分析表明,pmIL-18基因在COS7细胞中获得了瞬时表达。收集转染细胞培养上清,检测pmIL-18抗病毒活性,结果表明,转染上清对猪繁殖与呼吸综合征病毒没有明显的抑制作用。 相似文献
11.
为了提高猪生殖与呼吸综合征病毒山东株(PRRSV SD2株)基因免疫的效果,将PRRSV SD2 E基因插入哺乳动物表达载体PVAX1中,构建出PVAX1-E质粒。再将已筛选出的CpG-ODN序列通过在其两端的粘性酶切末端定向插入含PVAX 1-E的真核表达载体,构建含CpG基因序列真核重组表达质粒CpG-pVAX 1-E。将重组质粒转染COS-7细胞,经RT-PCR检测E基因mRNA的转录和间接免疫荧光试验(IFA)证实:CpG-pVAX 1-E可表达PRRSV GP5蛋白。试验结果为进一步研究PRRSV SD2 ORF5动物免疫反应奠定基础。 相似文献
12.
构建钙结合蛋白D28k(calbindin-D28k,CaBP-D28k)真核表达载体,并证实了其在真核细胞COS-1中的表达情况,为进一步研究该重组载体在动物体内的表达奠定了基础。通过酶切方法自含鸡CaBP-D28k基因的克隆质粒pGEM-T-CaBP-D28k中扩增CaBP-D28k基因,并将其克隆到真核表达载体pCDNA3中,阳性克隆鉴定后,在PEI作用下转染COS-1细胞,通过间接免疫荧光试验(IFA)检测到了CaBP-D28k在COS-1中的表达。 相似文献
13.
鸡传染性支气管炎病毒S1基因的真核表达及其产物的免疫原性 总被引：4，自引：0，他引：4
采用RT-PCR扩增出鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M 41株的全长S1基因,并将其片段连接到pGEM-T载体,经酶切、PCR及序列测定表明,获得的S1基因ORF全长为1 659 bp,与G enB ank上公布的IBV M 41 S1基因序列一致。将S1基因与真核表达质粒pVAX 1连接,构建重组真核表达质粒pVAX 1-S1。将重组质粒转染COS-7细胞,采用间接免疫荧光检测转染细胞S1蛋白的表达。同时以重组质粒免疫小鼠,可诱导产生特异性针对IBV S1蛋白的抗体(P<0.01)。这为鸡传染性支气管炎新型基因工程疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
14.
为制备猪TLR3(poTLR3)胞外区蛋白的多克隆抗体,从poTLR3克隆载体扩增胞外区基因序列连接到pGEX-4T-1载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下,表达GST-poTLR3融合蛋白,将表达的融合蛋白纯化,免疫家兔制备抗体,并以间接ELISA法测定抗体效价,利用Western-blot和细胞免疫荧光验证抗体与真核表达蛋结合的白特异性.结果表明:制备的多克隆抗体的效价可达1∶128 000,poTLR3胞外区蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并且制备的多克隆抗体特异性好、滴度高. 相似文献
15.
【目的】提高猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因免疫的效果,构建含CpG基序和PRRSV ORF5的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5。【方法】经酶切鉴定和序列测定,将重组质粒转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验证实CpG-pVAX1-ORF5可表达PRRSV GP5蛋白。免疫SPF小鼠,检测鼠的特异性抗体滴度、脾T淋巴细胞亚群数量（CD4+和CD8+）以及淋巴细胞增殖反应（MTT法）水平。【结果】本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5能诱导小鼠产生针对PRRSV的体液免疫与细胞免疫。【结论】CpG-ODN可提高PRRSV基因疫苗的免疫效果。 相似文献
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扩增萧山鸡白细胞介素2(IL-2)基因,将其插入真核表达载体pCI构建重组质粒pCI-IL-2,高压电击法将重组质粒转化入减毒沙门氏菌,并直接转染Vero细胞,提取细胞总DNA,DIG标记探针可检测到阳性杂交信号.用FITC标记的羊抗兔IgG进行间接免疫荧光试验,可检测到特异性黄绿色荧光.SDS-PAGE和Western blotting可检测到18.5 kD和14.5 kD的蛋白条带.表明减毒沙门氏菌能将重组质粒pCI-IL-2携带进入Vero细胞内表达IL-2,且表达产物具有免疫反应性,为今后研制鸡IL-2基因作为口服免疫增强剂提供了依据. 相似文献
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应用PCR扩增出新城疫病毒F基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序。然后将NDVF基因与高效的真核表达载体pcDNA4/HisMax相连,构建NDVF基因重组真核表达质粒pc4F,采用Superfect转染试剂将pc4F瞬时转染COS-7细胞,应用细胞免疫组化法检测其在细胞中的表达情况。结果表明,F基因能够在COS-7细胞中成功表达。 相似文献
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利用PCR从克隆质粒PMD18-T-pHIF-1α中扩增鼠兔HIF-1α;构建重组质粒pcDNA3.0/6Xmyc-p HIF-1α,用重组质粒转染HEK-293T,HeLa和COS-7细胞,通过免疫印迹分析,检测HIF-1α表达蛋白在细胞中的分布。EcoRI和XhoⅠ酶切鉴定和序列分析表明,构建的pcDNA3.0/6Xmyc-pHIF-1α真核表达载体序列正确;HIF-1α在真核细胞中能够正确表达,且其表达产物主要存在于细胞核中。 相似文献