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1.
《黑龙江畜牧兽医》2017,(15)
为了解保定地区奶牛源隐孢子虫感染情况,从当地3个奶牛场随机采集145份奶牛粪便经饱和蔗糖溶液漂浮后直接镜检和抗酸染色后镜检,阳性样品采用PCR方法扩增18S rRNA基因,同时将扩增出的目的片段进行克隆和序列分析,并将分离株与其他11个隐孢子虫参考株的18S rRNA序列进行比对和遗传距离比较。结果表明:有10份粪便样本为隐孢子虫阳性,感染率为6.9%(10/145),不同奶牛场、年龄段奶牛隐孢子虫感染率有显著性差异(P0.05)。10份粪便样品采用PCR方法扩增后有7份为18S rRNA基因阳性,扩增出的18S rRNA部分基因片段长528 bp。保定地区隐孢子虫分离株扩增的基因序列与牛源隐孢子虫18S rRNA基因序列(Gen Bank登录号为HQ179571)同源性最高,确定保定地区分离到的奶牛源隐孢子虫为牛隐孢子虫。 相似文献
2.
采进口奶牛粪样200份,收集每份样品中的卵囊液,采用巢式PCR检测隐孢子虫(Cryptosporidium)18S rRNA基因,并用RFLP进行虫种鉴定,将目的片段克隆到pEGM-T easy vector,测序并进行同源性分析以进一步佐证虫种鉴定结果。结果表明,进口奶牛隐孢子虫阳性率为3.5%(7/200),514bp的目的片段不能被EcoT14 Ⅰ酶切。测序分析表明,获得的18S rRNA基因序列与NCBI上公布的微小隐孢子虫(C.parvum)相应序列同源性高达99.4%~100%,与安氏隐孢子虫(C.andersoni)同源性仅为91.1%。说明进口牛粪样中检测出的隐孢子虫为微小隐孢子虫。 相似文献
3.
为阐明河南区域隐孢子虫分子流行病学特点,用PCR技术扩增分离虫株的18S rRNA基因全序列和HSP70基因序列,并对扩增片段进行测序。用PAUP 4.0和TREEPUZZLE 4.1构建进化树,试图从分子水平证明河南省不同地区不同宿主来源隐孢子虫的遗传特征,以阐明隐孢子虫病的分子流行病学特点。通过18S rRNA基因全序列和HSP70基因序列分析,其结果：河南人源隐孢子虫分离株为Cryptosporidium parvum鼠基因型;河南鹿源隐孢子虫分离株为C. parvum鹿基因型;河南猪源隐孢子虫的2个分离株均为C. parvum猪基因I型,即C. suis;河南鹌鹑源的隐孢子虫2个分离株分别为C. baileyi和C. meleagridis;河南乌鸡源隐孢子虫和鸵鸟源隐孢子虫分离株均为C. baileyi;河南牛源隐孢子虫分离株为C.andersoni。 相似文献
4.
《中国兽医学报》2019,(7):1325-1329
本研究从河北省奶牛场有腹泻症状2月龄左右的犊牛粪便中分离卵囊,进行病原分离与虫株鉴定。采集腹泻犊牛的新鲜粪便24份,采用饱和蔗糖溶液漂浮法和抗酸染色法检测隐孢子虫卵囊,观察卵囊形态、大小。提取卵囊基因组DNA,进行18S rRNA基因PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测。对扩增片段进行序列测定及分析,进一步确定分离虫株隐孢子虫的种类/基因型,根据18S rRNA基因核苷酸序列构建系统发育进化树,确定虫株亲缘关系。结果显示,5份样品检出隐孢子虫卵囊,感染率为20.83%。形态学观察卵囊呈长圆形或椭圆形,大小为(5.0～8.2)μm×(4.2～6.3)μm,平均大小为6.6μm×5.3μm,卵囊指数为1.24,鉴定分离虫株为安氏隐孢子虫。PCR扩增出预期大小为1 188 bp的特异性片段,序列分析和同源性分析结果表明,分离株与安氏隐孢子虫AB089285.2株、AB513856.1株、AY954885.1株的同源性为98.7%～98.8%,进一步表明分离的隐孢子虫虫株为安氏隐孢子虫。在种系进化关系上,分离株与安氏隐孢子虫AB513856.1株亲缘关系最近。本研究为揭示河北省奶牛隐孢子虫病的流行特征,实施有效防制措施提供了科学依据。 相似文献
5.
应用RT-PCR方法对南京、上海和合肥猪源隐孢子虫卵囊SSU rRNA部分序列进行扩增,产物测序后提交GenBank,收录号为DQ855266、DQ855267;用BLAST和DNAStar软件与GenBank参考序列进行比较,分析其同源性,绘制系统发育进化树,结合卵囊形态学观察和对小鼠、大鼠、兔、山羊和鸡的传染性试验确定隐孢子虫种类或基因型。结果表明,3地区猪源隐孢子虫分离株与微小隐孢子虫(C.parvum)同源性达94%~100%,与C.parvummouse型有99.8%~100%的同源性,并处于进化树的同一分支。因此,3地区猪源隐孢子虫是C.parvummouse型,提示猪和鼠之间存在交叉传播的可能。 相似文献
6.
利用18S rRNA巢式聚合酶链反应(Nested PCR)-限制片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)鉴定吉林、大庆地区牛源隐孢子虫分离株.采取吉林、大庆地区断奶前犊牛粪便,提取DNA后经18S rRNA基因巢式PCR扩增,扩增产物测序后用Blast和MEGA4.0软件进行同源性和系统发育树分析.同时扩增产物分别用Ssp Ⅰ、Vsp Ⅰ和Mbo Ⅱ酶切后进行RFLP分析.通过18S rRNA基因PCR-RFLP分析和测序比对分析表明,吉林分离株包括2种隐孢子虫,分别为C.bovis和C.ryanae,大庆分离株包括3种,分别为C.boris、C.ryanae和C.andersoni. 相似文献
7.
[目的]了解新疆南疆某规模化绵羊养殖场腹泻羔羊隐孢子虫感染情况和基因亚型分布特点。[方法]采集新疆维吾尔自治区某规模化绵羊养殖场4个品种1月龄以内腹泻羔羊新鲜粪便样本60份,使用饱和蔗糖溶液漂浮法检查隐孢子虫卵囊,进行种类初步鉴定;全部粪便样本提取基因组DNA后,基于隐孢子虫SSU rRNA基因位点和微小隐孢子虫gp60基因位点,对其进行PCR扩增、测序和序列分析,鉴定隐孢子虫种属和基因亚型,构建遗传进化树解析其分子遗传特征。[结果]经显微镜观察,发现38份样本呈隐孢子虫卵囊阳性,形态学初步鉴定为微小隐孢子虫;基于SSU rRNA基因位点,采用PCR方法检测出52份样本呈隐孢子虫阳性,感染率为86.67%(52/60),经序列比对分析,均为微小隐孢子虫;基于微小隐孢子虫gp60基因位点,PCR扩增后成功获得49条序列,经比对分析均为ⅡdA19G1基因亚型。[结论]该养殖场腹泻羔羊普遍感染微小隐孢子虫,其基因亚型均为ⅡdA19G1。调查结果为新疆南疆绵羊隐孢子虫种属鉴定与遗传进化研究提供了基础数据。 相似文献
8.
微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15基因的克隆及核苷酸序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
目的对编码微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)子孢子表面抗原CP15基因进行克隆和序列分析,并对其编码的氨基酸变异情况进行分析。方法对田间分离的鼠、兔、猪源微小隐孢子虫提取总RNA,经RT-PCR扩增CP15基因,克隆到pMD 18-T载体中,鉴定正确后进行序列测定,并与GenBank上下载的序列进行同源性比对。结果克隆的CP15基因核苷酸序列与GenBank登录的核苷酸序列比较,鼠源微小隐孢子虫同源性为99.23%,兔源微小隐孢子虫为97.96%,猪源微小隐孢子虫为98.72%,氨基酸序列同源性分别为100%、97.7%和98.4%。结论获得微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15基因,不同宿主来源的CP15基因序列高度一致,为利用该基因进行免疫预防和诊断研究奠定了基础。 相似文献
9.
基于18S rRNA基因测序基础上的锥虫分子分类学 总被引：2，自引：0，他引：2
利用18S rRNA基因序列分析方法,对我国湖北、广西、新疆和浙江4省的伊氏锥虫及1株布氏锥虫进行分子分类学研究.用分离的锥虫感染实验动物,自感染小鼠的红细胞或全血中提取基因组DNA,根据GenBank中已发表的雏虫18S rRNA序列设计1对锥虫通用引物,通过PCR扩增目的基因片段,将扩增产物连接到pGEM-T载体中,经酶切、PCR确定,进行序列测定.结果显示,7个锥虫分离株的18S rRNA基因大小为2 188 bp.利用DNAS-tar对试验所获得的这7株锥虫和GenBank中部分锥虫的18S rRNA基因进行比较分析,建立2个进化系统发生树.核苷酸同源性比较及系统发生树显示:自我国上述4省分离的伊氏锥虫来源于同一株系,布氏锥虫和广西分离的伊氏锥虫株的18S rRNA核苷酸与其他锥虫分离株仅有较小差异,与国外的6株锥虫的同源性为99%～100%,与另外7株的同源性为62%. 相似文献
10.
为调查新疆规模化奶牛场病牛死亡原因并确定病原,本研究无菌采集7份肺炎病死牛病变肺组织样,通过牛支原体液体培养基和固体培养基分离到1株支原体,采用形态学观察和生化试验鉴定该分离株,采用支原体特异性引物和牛支原体16S rRNA通用引物扩增基因序列并测序,使用DNAStar软件将分离菌株测序结果与GenBank中的标准株序列进行同源性比对,采用Mega 6.0软件中的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)依据16S rRNA序列构建分离株系统进化树。结果显示,分离株菌落呈典型的"煎蛋样",菌落中心凹陷深入培养基,周边菲薄而透明,经Dienes染液染色后,菌落中心呈深蓝色。该分离株不分解葡萄糖、尿素、不水解精氨酸,血细胞吸附试验和溶血试验均呈阴性,氯化三苯基四氮唑还原反应呈阳性,产生膜和斑。PCR反应扩增出大小为1 911 bp的牛支原体特异性目的片段;分离株16S rRNA基因序列与牛支原体标准株PG45的序列同源性为99.8%,与牛支原体地方株(Mb NM2012、Mb HB0801、Mb Hubei-1、Mb Ningxia-1、Mb CQ-W70和Mb 08M)的同源性为99.3%～99.7%。系统进化树显示,分离株16S rRNA基因与Mb Ningxia-1株和Mb 08M株亲缘关系较近,处于同一分支。本研究结果证实了引起病牛死亡的病原为牛支原体,为新疆牛支原体病的防治提供了科学依据。 相似文献
11.
为调查新疆规模化奶牛场病牛死亡原因并确定病原,本研究无菌采集7份肺炎病死牛病变肺组织样,通过牛支原体液体培养基和固体培养基分离到1株支原体,采用形态学观察和生化试验鉴定该分离株,采用支原体特异性引物和牛支原体16S rRNA通用引物扩增基因序列并测序,使用DNAStar软件将分离菌株测序结果与GenBank中的标准株序列进行同源性比对,采用Mega 6.0软件中的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)依据16S rRNA序列构建分离株系统进化树。结果显示,分离株菌落呈典型的"煎蛋样",菌落中心凹陷深入培养基,周边菲薄而透明,经Dienes染液染色后,菌落中心呈深蓝色。该分离株不分解葡萄糖、尿素、不水解精氨酸,血细胞吸附试验和溶血试验均呈阴性,氯化三苯基四氮唑还原反应呈阳性,产生膜和斑。PCR反应扩增出大小为1 911 bp的牛支原体特异性目的片段;分离株16S rRNA基因序列与牛支原体标准株PG45的序列同源性为99.8%,与牛支原体地方株(Mb NM2012、Mb HB0801、Mb Hubei-1、Mb Ningxia-1、Mb CQ-W70和Mb 08M)的同源性为99.3%～99.7%。系统进化树显示,分离株16S rRNA基因与Mb Ningxia-1株和Mb 08M株亲缘关系较近,处于同一分支。本研究结果证实了引起病牛死亡的病原为牛支原体,为新疆牛支原体病的防治提供了科学依据。 相似文献
12.
火鸡隐孢子虫18S核糖体DNA部分序列测定与系统发育分析 总被引：4，自引：0，他引：4
从长春地区鸭的粪便中分离纯化了火鸡隐孢子虫（Cryptosporidium meleagridis）卵囊，根据隐孢子虫18S rDNA基因序列设计合成引物，用PCR扩增了卵囊基因组DNA大小586bp的片段，PCR产物经电泳鉴定后用试剂盒回收纯化，纯化后PCR产物直接测序，将测得的序列用Dnastar软件分析并与国外已发表的相应序列进行了同源性比较，并绘制了系统发育进化树。结果初步建立了火鸡隐孢子虫的PCR检测方法，序列分析显示长春外国语源火鸡隐孢子虫与国外9株隐孢子虫相应序旬同源性在82.7%-99.8%之间，其中与国外火鸡源火允隐孢子虫相应序列同源性为85.3%；与C.felis同源性最低，与C.muris同源性最高。本研究为火鸡隐孢子虫病诊断及该病分子流行病学研究打下了良好基础。 相似文献
13.
为了解新疆某医院粪便样本中人源性隐孢子虫种系基因型,将收集来的腹泻病人粪便样本采用乙酸乙酯-改良抗酸染色法进行卵囊鉴定,同时提取隐孢子虫感染阳性样本的核酸,设计特异性引物扩增隐孢子虫的18 S rRNA基因和HSP70基因,依据所获得的目的基因序列构建系统发生分析。结果表明,新疆地区人粪便中隐孢子虫的阳性率为16.5%,高于全国平均水平。系统进化分析显示,其分子生物学特征主要为微小隐孢子虫(C.parvum)和人隐孢子虫(C.hominis)。说明新疆地区人源性隐孢子虫种系主要为C.parvum及C.hominis,具备人兽共患传播的可能性。 相似文献
14.
PCR-RFLP鉴定隐孢子虫种类研究 总被引：15，自引：2，他引：15
为快速、准确鉴别人畜隐孢子虫种类，建立了巢式PCR扩增隐孢子虫18S rRNA基因的特殊区域，扩增片段测序结果表明：安徽牛源分离株(Cryptosporidium muris)781bp；北京鸡源分离株(C.baileyi)776bp；北京牛源分离株(C.muris)781bp；河南牛源分离株(C.muris)725bp；长春牛源分离株(C.muris)776bp；宁夏鸡源分离株(C.baileyi)725bp.该片段位于18SrRNA全序列271～1103bp之间。使用Ssp I限制性内切酶消化发现C.muris产生418～420bp和305～363bp两个片段，C.baileyi产生544～545bp和185～231bp两个片段。所检测的6个分离株可以显著区分为C.muris和C.baileyi两个种，所建立的PCR-RFLP可以有效鉴别隐孢子虫种类。 相似文献
15.
奶牛源微小隐孢子虫的分子鉴定及动物感染试验 总被引：1，自引：0，他引：1
《中国兽医学报》2016,(1):85-89
采用饱和蔗糖溶液漂浮法检查商丘市某奶牛场牛新鲜粪便样本的隐孢子虫卵囊,用18SrRNA基因对隐孢子虫进行PCR扩增和限制性片段长度多态性分析;基于GP60基因位点对微小隐孢子虫进行基因亚型鉴定。结果显示:103份样本中有50份为隐孢子虫阳性,42份经形态学鉴定为安氏隐孢子虫,8份形态学未能鉴定到种。经限制性片段长度多态性分析,7个分离株为微小隐孢子虫,1个分离株为牛隐孢子虫;序列比对分析,7个微小隐孢子虫均为人兽共患基因亚型IIdA19G1。接种1头3日龄犊牛1×106个卵囊,潜隐期为3d,显露期为14d,于感染后第7天和第10天出现2个排卵囊高峰期,收集到大量纯卵囊。 相似文献
16.
从河南两个地区猪的粪便中分离纯化了猪源隐孢子虫卵囊。参考隐孢子虫Hsp70基因属特异性引物,用PCR分别扩增了卵囊基因组DNA大小均为1 948 bp的片段,PCR产物经电泳鉴定后用试剂盒回收纯化,纯化后PCR产物直接测序。将测得的序列和推测出的氨基酸序列分别用ClustalX软件与已报道的相应序列比对,用DNASTAR中的MegAlign分析其同源性,并用PAUP绘制系统发育进化树。序列分析结果显示河南猪源隐孢子虫两个分离株Hsp70 DNA序列的同源性为99.9%,与其他隐孢子虫相应序列同源性介于81.9%~99.8%之间,其中与猪隐孢子虫(Cryptosporidium suis,AF221533)同源性最高分别为99.8%,97.9%;与安氏隐孢子虫(C.andersoni,AY954592)同源性最低。两个分离株推导Hsp70氨基酸序列的同源性为100%,同其他隐孢子虫相关序列的同源性在92.8%~99.8%之间。本研究为隐孢子虫诊断及流行病学研究打下了良好基础。 相似文献
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《畜牧与兽医》2019,(12):82-85
为了开展曼氏迭宫绦虫(Spirometra mansoni)种系发育分析,本试验基于18S rRNA和5.8S rRNA基因保守区设计引物用于扩增包含18S rRNA、5.8S rRNA及核糖体内部转录间隔1区(ITS-1)的靶片段,对蛇体内分离的绦虫进行基因组DNA提取,然后采用PCR方法扩增目的基因,将所得序列进行测序比对并构建进化树分析。PCR结果显示,扩增片段大小为737 bp,序列经分析发现包括18S rRNA 17 bp,5.8S rRNA 421 bp,ITS-1片段为304 bp。同源性分析显示,其与猬迭宫绦虫同源性最高,高达86%;遗传进化树表明,其与猬迭宫绦虫广州株(FJ886754.1)最为接近,与微小膜壳绦虫(AF461124.1)关系最远。综上所述,本次分离的绦虫为曼氏迭宫绦虫,ITS-1基因可作为良好的分类工具区别不同种的迭宫绦虫。 相似文献
18.
19.
为明确内蒙古某规模化奶牛养殖场腹泻犊牛寄生虫性病原的感染情况及其分子学特性,采集该养殖场18头发生腹泻犊牛的新鲜粪便样品。通过形态学方法并结合分子生物学方法对样品中隐孢子虫(Cryptosporidium)和蓝氏贾第虫(Giardia lamblia)进行分离鉴定和感染情况统计分析。形态学检查结果表明,18份粪便样品中隐孢子虫感染率为5.56%(1/18),蓝氏贾第虫感染率为72.22%(13/18)。进一步对18份粪便样品提取DNA,并基于SSU rRNA和BG基因位点分别对隐孢子虫和蓝氏贾第虫进行PCR扩增、序列比对和遗传进化分析。电泳检测结果显示,显微镜检测阳性粪便样品均在830 bp和511 bp处出现目的扩增条带。同时,序列比对及遗传进化分析也表明,所分离到的隐孢子虫与来自于不同国家和地区的牛隐孢子虫(C.bovis)在SSU rRNA基因位点上具有100%序列同源性,因此被归于同一个进化分支,而所分离的蓝氏贾第虫在BG基因位点上与集聚体E参考分离株的序列同源性高达99.78%以上,提示其属于集聚体E。通过形态学和分子学方法明确了牛隐孢子虫和蓝氏贾第虫是该奶牛场主要致犊牛腹泻... 相似文献
20.
隐孢子虫不同基因型P23基因的克隆及序列比较 总被引：2，自引：1，他引：1
为克隆隐孢子虫不同基因型子孢子表面抗原P23基因,比较其序列差异,提取上海地区分离的隐孢子虫鼠基因型(Cryptosporidiummouse genotype)、隐孢子虫兔基因型(Cryptosporidiumrabbit geno-type)、隐孢子虫猪基因型Ⅱ(Cryptosporidiumpig genotypeⅡ)总RNA,经RT-PCR扩增P23基因,克隆到pMD18-T载体中,进行序列测定,并与GenBank上下载的微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)序列进行同源性比对。结果显示,从隐孢子虫3个基因型中均扩增出了P23基因。与微小隐孢子虫P23基因核苷酸序列比较,隐孢子虫鼠基因型、兔基因型、猪基因型ⅡP23基因同源性分别为97.6%、97.3%、97.3%,氨基酸序列同源性分别为97.3%、97.3%和96.4%。获得了隐孢子虫鼠基因型、兔基因型、猪基因型Ⅱ子孢子表面抗原P23基因。 相似文献