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1.
本研究针对A型猪塞内卡病毒(Senecavirus A, SVA)基因组保守区域设计了特异性引物及探针,建立了快速检测SVA的Taq Man荧光定量PCR方法。结果显示,以构建的重组质粒为标准品建立的Taq Man荧光定量PCR方法,标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数达0.9974;特异性良好,与口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒不存在交叉反应;对SVA核酸最低检测下限为3.75 copies/μL,而普通PCR最低检测下限为3.75×103 copies/μL;批内和批间的变异系数为均小于5%,重复性良好。本研究建立的SVA TaqMan荧光定量PCR方法为检测猪水疱性疾病病原提供了一种快速、灵敏的检测方法,为开展SVA流行病学调查提供了技术支持。 相似文献
2.
为建立一种鉴别猪塞内卡病毒A(SVA)、猪水疱病毒(SVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)的方法，针对3种病毒的基因保守区域设计引物和探针，建立了可同时检测上述3种病毒的TaqMan三重荧光定量PCR方法。该方法仅能特异性扩增SVA和FMDV病毒基因以及SVDV阳性质粒，与猪繁殖与呼吸综合征病毒、经典猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒的阳性样品cDNA或DNA无交叉反应，对3种病毒核酸的最低检出限均为10 copies/μL,组内和组间变异系数均小于4%。应用该方法对2019-2022年采集的吉林省部分地区267份病料和本实验室留存的30份猪血清样品进行检测，未检出SVA、FMDV以及SVDV。建立的三重荧光PCR方法有利于对3种病毒进行有效的流行病学调查，可给快速准确鉴别致猪水疱症状病毒性疾病提供诊断方法。 相似文献
3.
【目的】从含有127种化合物的FDA批准上市药物库中筛选具有颉颃A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)活性的化合物并研究其作用途径。【方法】利用荧光素酶重组塞内卡病毒(rSVA-NLuc)结合荧光素酶高通量筛选技术，建立抗SVA化合物体外筛选平台。从FDA批准上市药物库中筛选浓度为10μmol/L时具有抑制荧光素酶活性效应的化合物，并进一步利用实时荧光定量RT-PCR验证其抑制活性，通过反映乳酸脱氢酶(LDH)释放水平的细胞毒性试验进而确定其最大无毒浓度。针对病毒感染周期的吸附、入胞、复制和组装释放等4个主要过程，采用不同的细胞处理方法和实时荧光定量RT-PCR、间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay, IFA)、蛋白免疫印迹(Western blotting)和病毒滴度测定(TCID50)等技术进行化合物分子颉颃机制研究。【结果】从包含127种分子的FDA获批上市药物库中筛选出8种候选抗SVA活性分子，通过实时荧光定量RT-PCR及细胞毒性检测，鉴定出1种安全、有效的化合物——甲磺酸瑞波西汀。在病毒感染细胞... 相似文献
4.
为建立塞内卡病毒(SVA)荧光定量RT-PCR(FQ-PCR)检测方法,本研究根据GenBank中SVA 3D基因保守区域序列设计了一对特异性引物和一条特异性探针,以SVA cDNA为模板,经优化反应条件,建立了SVA FQ-PCR检测方法,并对其进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对28份临床疑似SVA感染样品进行了检测,并与本实验室建立的SVA RT-PCR方法检测结果及测序结果比较分析。结果显示,该方法仅对SVA出现阳性扩增信号,对BHK-21正常细胞对照和口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒Ⅱ型、猪伪狂犬病毒等5种病原均未出现扩增,特异性较强;该方法最低检测限为10.4拷贝/μL质粒标准品,比常规RT-PCR敏感性高10倍,敏感性较高;该方法批内及批间变异系数均小于4%,重复性好。利用该方法对28份疑似SVA感染样品检测显示,检出9份阳性样品,与测序结果一致,而常规RT-PCR仅检出6份阳性样品,其敏感性高于常规RT-PCR方法,两种方法的符合率为89.3%。本研究为SVA的早期检测提供了特异、敏感、快速的方法。 相似文献
5.
《中国兽医学报》2019,(12):2293-2297
根据对GenBank中2015-2017年登录的18株国内塞内卡病毒(SVV)基因组序列比对分析结果,设计合成1对针对SVV 5’UTR区域的特异性引物和Taqman探针,通过优化荧光定量PCR反应条件,建立一种定量检测SVV的Taqman实时荧光定量PCR检测方法。该方法定量检测范围在10～10~9 copies/μL,检测下限为10 copies/μL,比常规PCR检测灵敏度高约1 000倍,同时检测口蹄疫病毒(FMDV)、猪水疱病病毒(SVDV)、猪水疱疹病毒(VSV)、圆环病毒(PCV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)均为阴性,特异性良好;对50份疑似病料同时进行荧光定量PCR检测和常规PCR检测,结果显示荧光定量PCR阳性检测率(38%)高于常规PCR阳性检测率(25%),证实本试验建立的SVV Taqman实时荧光定量PCR检测方法可实现对SVV的临床诊断和定量分析。 相似文献
6.
【目的】从天然产物库中筛选具有颉颃A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)活性的天然产物并研究其颉颃作用机制。【方法】利用荧光素酶重组塞内卡病毒(rSVA-NLuc)与BHK-21细胞,结合荧光素酶高通量筛选技术,建立抗SVA药物体外筛选平台。从天然产物库中筛选浓度为10μmol/L时具有抑制荧光素酶活性效应的天然产物,并进一步利用实时荧光定量RT-PCR验证其抑制活性,通过细胞毒性试验确定其最大无毒浓度。选择病毒感染周期的吸附、入胞、复制、组装释放4个主要过程,利用实时荧光定量RT-PCR、50%组织细胞感染量(TCID50)测定等进行天然产物分子颉颃机制研究。【结果】从包含560种天然产物的分子库中筛选出16种候选抗SVA活性分子,通过实时荧光定量RT-PCR及细胞毒性检测,鉴定出4种安全、有效的天然产物,分别为20S-原人参三醇((20S)-protopanaxatriol)、蕈青霉素(paxilline)、方胆碱(fangchinoline)、竹红菌乙素(hypocrellin B)。作用机制研究显示,20S-原人参三醇能抑制SVA感染过程中的... 相似文献
7.
《畜牧与兽医》2020,(8)
为建立快速、灵敏且特异的检测猪圆环病毒3型(porcine circovirus, PCV)的实时荧光定量PCR方法,本研究根据ORF2基因的保守序列设计一对特异性引物和TaqMan探针,通过构建标准品质粒来制作荧光定量PCR标准曲线,优化反应条件,验证敏感性、特异性及重复性,建立了检测PCV3的实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法可以特异性检测出PCV3,而对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒等检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。用构建的标准品质粒测得的灵敏度可以达到10 copies/μL,重复试验批内及批间变异系数均小于2%,表明其具有良好的灵敏性和重复性。以上结果表明,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏性高、特异性强的优点,可为我国PCV3型的早期检测及相关研究工作提供可靠的技术支持。 相似文献
8.
《黑龙江畜牧兽医》2020,(14)
为了建立一种检测A型塞内卡病毒(SVA)VP2蛋白抗体的阻断ELISA方法,试验用SVA VP2蛋白作为抗原包被酶标板,采用棋盘法确定最佳蛋白包被浓度和单克隆抗体最佳稀释倍数。同时对阻断ELISA的其他条件(封闭液、血清稀释度、底物反应条件)进行优化,对方法的特异性和重复性进行考察。结果表明:VP2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL;最佳封闭液为2%BSA,每孔200μL,37℃封闭1 h;待检血清最佳稀释度为1∶1,在37℃条件下作用1 h;单克隆抗体最佳稀释度为1∶40 000,在37℃条件下作用1 h;底物最佳反应条件为室温避光10 min。特异性试验结果显示,SVA阳性血清与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综征病毒、猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应。批间、批内重复性试验结果的变异系数均小于10%。对200份猪血清样本进行荧光抗体中和试验和阻断ELISA方法检测,符合率为96.0%。说明该ELISA方法具有良好的特异性和重复性,可用于塞内卡病毒血清抗体检测和流行病学调查。 相似文献
9.
《动物医学进展》2020,(5)
为建立一种快速、特异、灵敏的A型塞尼卡病毒(SVA)检测方法,通过比对我国不同地区SVA流行毒株的VP1基因序列,在其保守区域设计了1组引物和探针,通过条件优化,建立了基于TaqMan探针的荧光定量RT-PCR检测方法。用该方法检测口蹄疫病毒、猪瘟病毒、日本脑炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒等均不发生交叉反应。敏感性分析显示,该方法的最低检出量为278拷贝/μL,比常规RT-PCR的灵敏度高100倍。重复性分析显示,所建立方法的批内变异系数为0.3%～1.0%,批间变异系数为0.8%～2.0%,具有良好的稳定性。进一步对16份疑似SVA感染的临床病料检进行了检测,结果显示8份为SVA核酸阳性。提示建立的检测方法可以用于临床SVA感染的鉴别诊断,为我国SVA的诊断和控制提供了良好的技术支撑。 相似文献
10.
研究旨在了解河池市屠宰猪群主要疫病感染情况,于2019—2022年采集屠宰猪群组织混合样品,应用实时荧光定量RT-PCR检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、口蹄疫病毒（FMDV）、猪塞内卡病毒（SVA）,应用荧光PCR检测圆环病毒2型（PCV2）、圆环病毒3型（PCV3）、伪狂犬病毒（PRV）。结果显示,检测的1 745份样品中,除FMDV和PRV没有检出外,其余5种病原均有检出,样品总体阳性率由高到低依次为42.87%(PCV2)、11.63%(PCV3)、8.48%(PRRSV)、0.80%(CSFV)、0.80%(SVA);县区检出率依次为100.00%(PCV2)、100.00%(PRRSV)、90.91%(PCV3)、54.55%(CSFV)、27.27%(SVA);5种病原存在不同程度的混合感染。研究表明,圆环病毒病、猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟在河池市及其周边地区猪群中流行普遍,需进一步加强监测和做好防控措施。 相似文献
11.
《中国兽医学报》2020,(3)
根据K亚群禽白血病病毒(ALV-K)gp85基因序列设计1对引物,对反应条件和反应体系进行优化,建立了快速检测ALV-K的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。该方法在1～10~7 copies/μL范围内具有良好的线性关系,灵敏度达到1 copies/μL,是常规PCR方法的100倍。该方法与经典亚群ALV及其他常见禽免疫抑制病病毒无交叉反应,批间与批内重复性试验变异系数均小于2%。将ALV-K原型株JS11C1通过卵黄囊接种途径感染SPF鸡,运用本试验建立的实时荧光定量PCR方法,对感染鸡体内各器官的病毒分布及病毒载量进行了检测。结果显示,在感染鸡的心脏、脾脏、肺脏、肾脏等器官中均可检测到病毒,其载量无明显差异。结果表明,本试验所建立的实时荧光定量PCR方法具有敏感度高、特异性强和重复性好的优点,可用于ALV-K的快速、定量检测,该方法同时为ALV-K致病机制的研究提供了良好的技术手段。 相似文献
12.
为建立快速检测塞内卡病毒A (Senecavirus A,SVA)血清学方法,以纯化的重组VP1蛋白作为包被抗原,建立了SVA VP1间接ELISA抗体检测方法。结果表明,VP1蛋白以包涵体形式表达,纯化后的蛋白经Western blot鉴定具有较好的反应原性。该ELISA检测方法阴、阳性临界值为0.278,与口蹄疫病毒(FMDV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等猪常见病原阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。批内和批间重复性试验的变异系数均小于13%,表明该方法重复性和稳定性均较好。相比于血清中和试验(SN),该方法的相对敏感性为98.0%,两种方法的符合率为84%。用该方法对来自山东、广东省的8个猪场的276份血清进行检测,阳性率为22.1%。SVA VP1间接ELISA抗体检测法可作为一种快速、简便的血清学诊断方法,用于猪群SVA感染监测和流行病学初步调查。 相似文献
13.
14.
《中国动物传染病学报》2018,(5)
根据猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2基因的保守序列,设计合成一套特异性引物和TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件进行优化后,检测其特异性和灵敏性。结果显示,本研究建立的实时荧光定量PCR在101～108范围内线性相关系数为0.997,能够检测到相当于10 copies/μL的病毒核酸,比常规PCR检测方法敏感性强;采用建立的实时荧光定量PCR方法检验猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型呈现阴性结果,特异性强;变异系数为0.09%～0.7%,小于1%,具有良好的重复性。本研究建立的猪瘟病毒实时荧光定量PCR方法为临床上猪瘟病毒的诊断和定量研究提供了重要的检测工具。 相似文献
15.
《中国兽医杂志》2019,(5)
为建立一种准确、特异、高效、快速的非洲猪瘟病毒定量检测方法,本研究根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)早期表达基因K196R的基因序列,设计了TaqMan荧光定量PCR引物及探针,通过优化退火温度、引物及探针浓度,建立了快速检测ASFV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法选择的引物具有高度灵敏性和特异性,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系(R~2=0.998),对ASFV核酸最低检测下限为1.3拷贝,且与猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等多种病原不存在交叉反应。本研究建立的K196R基因实时荧光定量PCR检测方法为非洲猪瘟疫情提供了一种新型、灵敏和特异的早期检测方法。 相似文献
16.
为建立一种快速且准确检测鸭源鹅细小病毒（D-GPV）的实时荧光定量PCR方法,本研究通过分析D-GPV基因序列的保守区设计并合成一对特异性引物,构建携带NS1基因的重组质粒作为标准品,绘制实时荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性、特异性、重复性试验和临床样品的检测。结果显示,该方法标准曲线的的线性关系良好,相关系数为0.999;灵敏度高,检测底限为10拷贝;特异性与重复性好,与其他病毒无交叉反应,批间和批内变异系数均低于1%。该方法对人工感染D-GPV鸭泄殖腔拭子和咽拭子样品的检测结果显示,鸭在攻毒后第1 d即可以通过口腔和泄殖腔向外排毒,排毒量在第3 d达到高峰,排毒持续期可达到42 d。本研究所建立的实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性和稳定性好,可用于临床样品中的D-GPV检测。 相似文献
17.
《中国畜牧兽医》2020,(5)
试验旨在建立一种高灵敏性的马疱疹病毒1(EHV-1) 3D数字PCR(3D-dPCR)检测方法,对EHV-1病毒含量较低的样品能准确定量检出,实现马鼻肺炎早期诊断及预防。根据EHV-1糖蛋白B基因保守区域设计特异性引物和探针,优化3D-dPCR反应体系中引物探针浓度和退火温度,对该方法进行灵敏性、特异性、重复性分析,建立了EHV-1的3D-dPCR方法。本研究建立的3D-dPCR方法,引物和探针最佳浓度分别为0.4和0.4μmol/L,最佳退火温度为60℃,该方法绝对定量曲线的R~2=0.998,线性关系良好,与实时荧光定量PCR方法相比灵敏度高10倍左右,最低检出限为5.83拷贝/μL;批内和批间重复性试验变异系数均3.2%;与EHV-4、马泰勒虫、马病毒性动脉炎的核酸无交叉反应;通过对123份临床样品进行3D-dPCR检测,结果显示,3D-dPCR方法阳性检出率为66.7%,高于世界动物卫生组织(OIE)中EHV-1的实时荧光定量PCR方法阳性检出率64.2%。3D-dPCR方法对病毒含量较高的样品与实时荧光定量PCR结果一致,对病毒含量较低的样品敏感性更高,能有效检出可疑样品。本试验结果表明,建立的3D-dPCR方法检测低拷贝数的临床样品时灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于EHV-1的准确定量检测。 相似文献
18.
为建立检测口蹄疫病毒(FMDV)的方法,本研究根据GenBank中FMDV的2B基因序列,设计合成一对引物和一条TaqMan探针,将2B基因克隆到pBlueScriptSK(-)载体中,利用T7体外转录试剂盒制备标准品,通过优化反应条件,建立了TaqMan荧光定量PCR检测方法.结果表明,该检测方法的敏感性达到102拷贝/μL;与其它主要相关病毒均不发生交叉反应,批内和批间试验重复性的变异系数(CV)均小于3％.本研究建立的FMDV TaqMan荧光定量PCR方法对FMDV的快速检测具有重要意义. 相似文献
19.