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1.
根据GenBank上发表的猪附红细胞体16S rRNA基因序列(登录号U88565)设计合成2对引物,建立了猪附红细胞体单管巢式PCR诊断方法,经酶切分析、单管巢式PCR进一步鉴定后进行序列测定,并与血涂片染色镜检、常规PCR进行了比较。结果:扩增的猪附红细胞体基因序列与GenBank中发表的猪附红细胞体基因序列(U88565)同源性为96%;特异性试验表明,设计的引物不能扩增弓形虫、链球菌、大肠杆菌、葡萄球菌及羊附红细胞体等病原体;敏感性试验表明,单管巢式PCR诊断方法最低能够检测出0.116 fg的标准模板DNA。通过对75份血液样本的检测表明,建立的单管巢式PCR方法明显优于血涂片染色镜检法及常规PCR方法,具有较高的敏感性和实用性。本试验建立的单管巢式PCR诊断方法具有特异、敏感、实用等优点,为猪附红细胞体的检测提供了一种新型、可靠的诊断技术。 相似文献
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为建立一种特异、敏感、准确的猪附红细胞体诊断技术,本试验根据GenBank上发表的猪附红细胞体全基因组(NC-015153.1)中的DnaJ基因序列设计合成了一对特异性引物,建立了猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法,进行了特异性和敏感性试验,并与姬姆萨染色镜检方法进行了临床应用比较.结果,猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法扩增片段大小为868 bp(GenBank登录号为;JN247670),与GenBank中(NC_015153.1)同源性为99％,该方法扩增不出犬新孢子虫、牛附红细胞体、犬附红细胞体等基因片段,最低检测猪附红细胞体DNA量为124 fg/μL,通过对53份猪血液样本的检测,并与血液涂片姬姆萨染色镜检比较,说明建立的PCR诊断方法具有特异、敏感、准确等优点,完全适用于猪附红细胞体的诊断. 相似文献
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通过将GenBank上报道的犬附红细胞体16S rRNA基因序列与其他物种同源序列进行比对,取其种间特异性和种内保守性较高区域设计1对引物,以吉林省延边地区犬附红细胞体基因组DNA为模板进行PCR扩增,并进行特异性、敏感性试验验证,建立犬附红细胞体PCR诊断方法,应用于临床检测。结果表明:该方法可成功扩增出大小为529 bp的犬附红细胞体片段,与GenBank中German no.1(AY150973.1)序列同源性为98.5%。其最低DNA检测量为25 fg/μL,不与犬巴贝斯虫、犬弓形虫及猪附红细胞体等病原体基因组产生交叉反应。同时通过对57份犬血液样本的检测结果说明,该方法检出率明显高于姬姆萨染色镜检法,且避免了假阳性。本试验所建立的PCR检测方法具有特异、敏感、准确等优点,为犬附红细胞体病的诊断提供了一种可靠的方法。 相似文献
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猪附红细胞体特异性基因的克隆和PCR诊断方法的建立 总被引：10，自引：0，他引：10
根据2003年Hoelzle发表的猪附红细胞体的基因组序列（AJ504999）设计一对特异性引物,对病料样品进行PCR扩增并将其产物克隆到pMD18-T载体后测序,结果表明扩增出的片段为603bp,同源性分析表明该序列与参考基因组序列同源性为100％,反映出我国分离株与国外株其基因无差异,特异性和敏感性试验表明,所建立的PCR诊断方法与常见的支原体、细菌及原虫无交叉反应,能检测到猪附红细胞体血液基因组DNA最低量为0．65ng／mL,该方法具有快速、特异、敏感等特点,为猪附红细胞体病的快速诊断及流行病学调查提供了新的手段。 相似文献
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根据GenBank上发表的牛卵形巴贝斯虫CCTη基因序列设计合成2对巢式PCR引物,建立牛卵形巴贝斯虫巢式PCR诊断方法,对该方法的最佳反应条件进行了筛选,并进行了特异性、敏感性及临床样本检测试验。结果表明,建立的巢式PCR方法外引物扩增牛卵形巴贝斯虫基因组片段的长度为1 008bp,内引物为537bp;该方法扩增不出牛瑟氏泰勒虫、弓形虫、犬新孢子虫基因组DNA;最低检测DNA含量为16fg;通过对46份临床样本的检测,该巢式PCR较常规PCR阳性检出率高8.7%。本试验为牛卵形巴贝斯虫病的诊断提供了一种更为特异、敏感的检测技术。 相似文献
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猪附红细胞体PCR检测方法的建立和初步应用 总被引：22，自引：1，他引：22
基于猪附红细胞体广东株16S rRNA基因的序列特点，设计合成种特异性引物，建立了猪附红细胞体PCR检测方法。该方法能特异性扩增523bp的猪附红细胞体16SrRNA基因片段，而对猪丹毒杆菌G4T10株、猪链球菌STl71株、多杀性巴氏杆菌E0630株、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、鸡毒支原体和猫血巴尔通氏体CA株的基因组DNA没有扩增带出现。对猪附红细胞体基因组DNA的最小检测量为160pg。通过对38份临床样品的检测，8份为猪附红细胞体感染阳性，其余为阴性。结果表明，建立的PCR检测方法具有极高的敏感性和特异性，可用于急性猪附红细胞体病和临床健康带菌猪的诊断。 相似文献
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猪附红细胞体PCR诊断方法的建立及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
根据基因库中已登录的猪附红细胞体新的基因组DNA序列设计引物,从疑似猪附红细胞体(Mycoplasma suis)感染猪全血样品基因组DNA中扩增出了预期长度666 bp的目的DNA片段,通过对24份临床疑似病例样品的PCR扩增及其他病原微生物基因组DNA的特异性扩增试验,建立了E.suis的PCR诊断方法;进一步对PCR产物克隆、测序分析表明,与国外已报道的AJ504999株相关区域核苷酸、氨基酸序列同源性分别为98.19%和96.85%,表明我国分离株与国外株基因组存在差异。 相似文献
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奶牛附红细胞体的分类鉴定及诊断方法的建立 总被引：5，自引：0，他引：5
为了从分子水平上确定奶牛附红细胞体（E．wenyoni）的分类学地位及建立奶牛附红细胞体感染诊断方法。本研究通过利用原核生物16S rRNA基因通用引物，对分离得到的奶牛附红细胞体（广西株，E．wenyoni-GX）进行16SrRNA基因的克隆及测序。并建立系统发育进化树；同时根据测序结果设计诊断引物，建立奶牛附红细胞体感染的PCR诊断方法。结果扩增出长约1．5kbp的奶牛附红细胞体的16SrRNA基因片段；特异性试验和敏感性试验表明。所建立的PCR方法与常见支原体、细菌及原虫元交叉反应，能检测奶牛附红细胞体最低DNA量为0．145fg。通过试验结果分析，建议将奶牛附红细胞体这类血营养菌划归入支原体科、支原体属；同时，所建立的PCR诊断方法是特异、敏感、快速的，可应用于临床检测。 相似文献
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牛附红细胞体单管套式PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
为快速、准确地检测出牛附红细胞体,根据GenBank上发表的牛温氏附红细胞体(Mycoplasma wenyonii)l6S rRNA基因序列(登录号AF016546)设计合成内外2对引物,建立了牛附红细胞体单管套式PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性及应用试验。结果:建立的牛附红细胞体单管套式PCR检测方法扩增的片段大小为361 bp,与GenBank中相应序列同源性为98%,该方法扩增不出牛瑟氏泰勒虫、新孢子虫、布氏杆菌及牛无乳链球菌等基因片段,检测出标准模板DNA的最小量为1.22 fgμ/L。通过对吉林省延边地区66份血液样本的临床检测显示,单管套式PCR检出率28.8%,高于常规PCR的21.2%和鲜血压片镜检的12.1%,具有准确、特异、敏感等优点,是检测牛附红细胞体的一种新型、可靠的诊断技术。 相似文献
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猪附红细胞体16S rRNA基因的序列测定和系统进化分析 总被引：11，自引：3，他引：11
从确诊为猪附红细胞体感染的猪场，无菌采集血样，抽提猪附红细胞体基因组DNA，采用真细菌的通用引物进行16S rRNA基因扩增，对扩增产物进行克隆和测序。从3个地理位置不同的猪场均成功地扩增出长度为1469bp的核苷酸序列。系统进化分析表明，3个猪场样品所测序列一致性达99．52％以上，具有相同的基因型，但与国外报道的猪附红细胞体Illinois株同源性为95％，属于同一基因群，但基因型不同；所有种类的附红细胞体和血巴尔通氏体组成同一进化分支，这类血营养菌与支原体科，支原体属的病原最靠近(75％)，而与立克次氏体目的病原较远(70％)。上述研究证实，广东所流行的猪附红细胞体是一种新基因型的猪附红细胞体，建议命名为猪附红细胞体广东株型；为反映进化关系，猪附红细胞体和其它血营养菌应划归于支原体科的支原体属。 相似文献
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为了研究猪附红细胞体信号识别颗粒54（SRP54）基因的功能,试验根据GenBank上发表的猪附红细胞体KI3806全基因组序列（登录号为NC015153.1）中信号识别颗粒（SRP）蛋白基因设计合成1对特异性引物,采用PCR方法扩增猪附红细胞体SRP54基因片段,将扩增产物克隆至pMD18-T载体上,重组质粒经PCR和酶切鉴定后测序,并将SRP54基因与pVAXⅠ真核表达载体连接。结果表明:克隆的SRP54基因片段长1 173 bp,与GenBank中原序列同源性为97%,构建的真核表达质粒pVAXⅠ-SRP54经PCR和酶切鉴定正确,为猪附红细胞体SRP54基因的后续研究奠定了基础。 相似文献
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Development and evaluation of a polymerase chain reaction assay using the 16S rRNA gene for detection of Eperythrozoon suis infection. 总被引：17，自引：0，他引：17
The 16S ribosomal RNA (rRNA) gene of Eperythrozoon suis was amplified using gene-specific primers developed from GenBank sequence accession U88565. The gene was subsequently cloned and sequenced. Based on these sequence data, 3 sets of E. suis-specific primers were designed. These primers selectively amplified 1394, 690, and 839 base-pair (bp) fragments of the 16S rRNA gene from DNA of E. suis extracted from the blood of an experimentally infected pig during a parasitemic episode. No polymerase chain reaction (PCR) products were amplified from purified DNA of Haemobartonella felis, Mycoplasma genitalium, or Bartonella bacilliformis using 2 of these primer sets. When the primer set amplifying the 690-bp fragment was used, faint bands were observed with H. felis as the target DNA. No PCR products were amplified from DNA that had been extracted from the blood of a noninfected pig or using PCR reagents without target DNA. The detection limits for E. suis by competitive quantitative PCR were estimated to range from 57 and 800 organisms/assay. This is the first report of the utility of PCR-facilitated diagnosis and quantitation of E. suis based on the 16S rRNA gene. The PCR method developed will be useful in monitoring the progression and significance of E. suis in the disease process in the pig. 相似文献
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Detection of Eperythrozoon suis DNA from swine blood by whole organism DNA hybridizations 总被引：10，自引：0，他引：10
A procedure is described for isolating Eperythrozoon suis DNA of sufficient quantity and purity to serve as a probe in whole-organism DNA hybridizations for detecting parasitized swine. The E. suis organisms were isolated from the blood of infected swine; the DNA was recovered and digested with restriction endonucleases and resolved on agarose gels. In DNA hybridizations using recovered E. suis DNA, blood samples from parasitized swine could be differentiated from uninfected, control samples. A high salt lysate recovery technique was used in sampling swine whole blood for E. suis DNA and found to offer many advantages in the collection and recovery process. 相似文献