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1.
为了对微小隐孢子虫(C.parvum)类钙调蛋白(CML)基因进行原核表达,分析重组表达蛋白的反应原性。以C.parvum卵囊cDNA为模板,用PCR方法扩增得到C.parvum CML基因。将CML基因连接到克隆载体pMD18-T,获得重组质粒pMD-CML,经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,连接到经相同内切酶酶切的表达载体pGEX-6p-1上,构建重组表达质粒,转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中进行诱导表达。利用GST亲和树脂法纯化重组表达蛋白,对纯化的重组蛋白进行Western blot分析。结果表明,成功构建了重组原核表达质粒pGEX-CML,重组质粒转化菌经IPTG诱导后成功地表达出了分子质量约为51ku的重组蛋白rCML,纯化的蛋白rCML能与感染兔隐孢子虫(C.cuniculus)的兔血清发生特异性反应,具有很好的反应原性。 相似文献
2.
为探讨微小隐孢子虫的入侵机制,克隆、表达了微小隐孢子虫LCCL结构域基因。从已构建的微小隐孢子虫cDNA文库中,采用PCR随机扩增LCCL结构域基因。与Pmd-18-T载体连接后,挑取阳性重组子测序分析。用基因重组技术将LCCL结构域基因克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建LCCL结构域基因的重组原核表达载体pGEX-4T-1-LCCL。重组质粒经酶切、测序鉴定后转入大肠埃希菌BL21中,IPTG诱导表达目的蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。最终得到了在大肠埃希菌中高效表达的重组蛋白,分子质量大小约为37ku,并且具有反应原性,为进一步研究微小隐孢子虫的入侵机制奠定了基础。 相似文献
3.
为将微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)P23基因在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)系统中进行表达,利用表达蛋白初步建立隐孢子虫病间接ELISA诊断技术,设计引物从微小隐孢子虫基因组DNA中扩增P23基因序列,构建pPIC9K-P23重组质粒,在毕赤酵母中进行表达,用阴离子交换层析柱进行纯化。以重组P23纯化蛋白为抗原建立间接ELISA检测方法,对现场采集的猪血清样品进行检测。SDS-PAGE显示所表达的蛋白大小约为23 kDa。Western blot检测表明该蛋白能与兔抗P23蛋白血清特异性结合。用建立的间接ELISA技术对186份猪血清样品进行检测,阳性率为83.3%。本研究获得了真核表达的P23重组蛋白,初步建立了微小隐孢子虫病间接ELISA诊断技术,为隐孢子虫病的诊断和流行病学调查打下了基础。 相似文献
4.
依据NCBI中安氏隐孢子虫囊壁蛋白(COWP)编码基因设计特异性引物,提取安氏隐孢子虫长春株总RNA,RT-PCR扩增目的基因AF,构建重组原核表达载体pET28a-AF,通过大肠杆菌BL21诱导表达,产物经SDS-PAGE以及Western blotting鉴定。然后纯化重组蛋白,通过免疫BALB/c小鼠进行体液免疫和细胞免疫水平的检测。结果显示,重组原核表达质粒pET28a-AF构建成功,Western blotting显示重组蛋白约为18 000,可被安氏隐孢子虫免疫小鼠的多克隆抗体和HRP标记的抗组氨酸抗体识别。重组蛋白免疫BALB/c小鼠的抗体水平差异显著(P0.05),与对照组相比,CD4+的值差异极显著(P0.01),而CD8+的值差异显著(P0.05)。结果表明,成功克隆并表达了重组安氏隐孢子虫囊壁蛋白,纯化的重组蛋白具有一定的免疫原性。 相似文献
5.
本研究旨在克隆微小隐孢子虫黏附相关蛋白基因CP21开放阅读框,构建其原核表达质粒,并对获得的融合蛋白进行鉴定。从含CP21基因的噬菌体中提取模板DNA,PCR扩增基因片段,构建pET-28a-CP21原核表达质粒,转化至埃希氏大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定。用原核表达蛋白免疫小鼠,制备抗重组蛋白多抗,对蛋白进行定位。结果表明成功扩增出CP21基因,并构建原核表达质粒,转化至大肠杆菌中表达出相对分子质量为25 ku的融合蛋白,Western blotting证明表达的CP21融合蛋白能与抗C.parvum多克隆抗体产生特异性反应。免疫荧光结果表明:CP21基因在子孢子和卵囊期均表达,且表达产物位于子孢子表膜和卵囊壁表面。CP21是一种与侵入机制有关的黏附相关蛋白。研究结果为微小隐孢子虫的免疫学诊断及疫苗研制奠定了基础。 相似文献
6.
为原核表达鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)NS1重组蛋白,本研究通过RT-PCR方法扩增NS1基因,将其亚克隆至pET32a(+)载体中构建重组表达质粒pET32a-NS1。将其转化大肠杆菌Rosetta中,经IPTG诱导表达了约59 ku的重组蛋白。Western blot分析表明,该重组蛋白可以与DTMUV阳性血清发生特异性反应,表明其具有良好的反应原性。 相似文献
7.
试验旨在构建微小隐孢子虫表面抗原CP15基因原核表达载体并获得重组CP15蛋白。试验以已知重组质粒pMD-CP15为模板,PCR方法扩增出CP15基因片段,并亚克隆到pGEX4T-3,构建了在E.coli BL21中GST融合表达载体pGEX-CP15;经1 mmol/L IPTG进行诱导表达获得目的蛋白,其大小采用SDS-PAGE电泳和Western blotting进行鉴定。结果表明,扩增出约390 bp的微小隐孢子虫表面抗原CP15基因片段并成功构建pGEX-CP15质粒,表达出分子质量为42 ku的融合蛋白,与推导的理论值相符。Western blotting显示该蛋白能被GST血清识别。牛微小隐孢子虫表面抗原CP15基因在大肠杆菌中得到了高效表达。 相似文献
8.
新城疫病毒F基因在大肠埃希菌中的表达及其抗原性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
构建新城疫病毒融合蛋白F基因的原核表达载体,并将其在宿主菌BL21(DE3)感受细胞中表达.以含有融合蛋白F基因的重组质粒pMD19T-F为模板,设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得F基因的F1片段,定向插入原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-F1,将构建成功的重组质粒pET-F1转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导,将其在宿主菌细胞中表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot方法检测.结果显示,成功克隆出了新城疫病毒F1基因片段序列852 bp.构建的pET-F1载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误,转化表达宿主菌后经SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,目的基因被成功表达,并具有良好的反应原性.成功构建了新城疫病毒的融合蛋白F基因原核表达载体,转化宿主细胞后成功表达了融合蛋白F1重组蛋白片段. 相似文献
9.
采用PCR技术扩增了微小隐孢子虫Cp23基因,将Cp23基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达载体pET28a-Cp23。将其转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blot分析。SDS-PAGE结果表明,蛋白相对分子质量为25 000,目的蛋白高效表达,且为包涵体蛋白。Western blot结果表明,表达产物可被微小隐孢子虫阳性血清识别,具有良好的免疫反应原性。本研究为抗微小隐孢子虫疫苗和免疫学诊断方法的研制提供候选抗原。 相似文献
10.
以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增UL6全长基因,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定.序列分析显示UL6全长1 938 bp,可编码646个氨基酸.将该基因克隆到插入原核表达载体pET28a的6×His下游,获得原核表达质粒pET28a-UL6,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导在大肠埃希菌中成功表达获得分子质量约70 ku的融合表达蛋白6×His-UL6,Western blot证实,表达的融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生特异性反应.根据测定的序列,设计一对能扩增UL6基因完整编码区的引物,PCR扩增UL6基因并将其插入真核表达载体pEGFP-C2中EGFP基因的3'端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL6,转染Hela细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现,转染48 h,融合蛋白EGFP-UL6主要定位在胞浆,为进一步研究伪狂犬病病毒Ea株UL6基因的结构和功能奠定了基础. 相似文献
11.
构建致倦库蚊(贵阳株)天蚕素B2(CecB2)基因原核表达载体,并原核表达获得重组蛋白。定向克隆CecB2成熟肽序列至原核表达载体pET32a(+)上,将成功构建的pET32a-CecB2重组表达质粒转化大肠埃希菌Rosetta中经IPTG诱导表达,对IPTG诱导浓度和诱导时间优化后表达所得目的蛋白采用镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blot检测鉴定表达蛋白。结果表明,成功构建原核表达载体pET32a-CecB2,IPTG浓度和时间优化结果为IPTG浓度为0.05mmol/L,诱导时间为3h。SDS-PAGE检测获得大小约25ku的可溶性纯化蛋白,Western blot鉴定纯化蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生抗原抗体结合反应。说明所构建原核表达载体pET32a-CecB2能在大肠埃希菌中可溶表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。 相似文献
12.
应用多个抗原袁位预测软件对微小隐孢子虫CP15、P23和CP15/60三个子孢子表面抗原的氨基酸序列进行T细胞袁位预测及分析,从中选取了三个抗原表位富集的基因片段,利用重叠延伸PCR(gene splicing by overlapping extension PCR,SOE PCR)将该三个基因片段串联在一起,各基因片段之间以柔性氨基酸(GGGGS)碱基序列链接,得到的拼接片段命名为CpTm.将目的基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组表达质粒pET-CpTm,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体.结果成功地构建了CpTm串联基因并在大肠杆菌中以可溶形式高效表达,质谱分析表明重组表达蛋白包含了上述三个抗原的氨基酸序列.Western blot分析显示该重组蛋白能被牛抗微小隐孢子虫阳性血清及隐孢子虫鼠基因型CP15、P23、CP15/60基因重组表达蛋白免疫兔血清识别,制备的抗血清能被重组蛋白特异性识别,表明表达的重组蛋白具有较好的反应原性和免疫原性,为多表位疫苗的研制奠定了基础. 相似文献
13.
以微小隐孢子虫基因组DNA为模板,PCR扩增获得子孢子表面抗原CP15、P23和CP15/60基因。利用重叠延伸PCR(SOE PCR)将该3段基因片段串联在一起,各基因片段之间引入柔性氨基酸接头(GGGGS)编码基因。将串联基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组表达载体,转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中进行诱导表达,将纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体。结果表明,获得了CP15-P23-CP15/60融合基因,并在大肠埃希菌中高效表达,Western blot显示重组蛋白能被牛抗微小隐孢子虫阳性血清识别,制备的多克隆抗体能被重组蛋白特异性识别,表明获得的重组蛋白具有较好的抗原性。 相似文献
14.
构建大片吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶(Fg.TPx)原核表达质粒,经大肠埃希菌Rosetta表达融合蛋白(Fg.TPx/His)并对其进行纯化和初步鉴定。PCR扩增Fg.TPx的基因片段,亚克隆至pET32a(+)中构建重组表达载体pPET32a-Fg.TPx。IPTG诱导表达,经镍离子亲和层析分离纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。重组质粒经限制性内切酶双酶切和测序分析表明构建成功,表达产物以可溶性和包涵体形式存在,纯度为90%,Wsetern blot证实该蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合反应,分子质量为TPx和His分子质量之和,表明是融合蛋白。重组蛋白可以被大片吸虫感染水牛阳性血清特异性识别。免疫家兔产生的抗体效价最高可达1∶4 000。成功构建了p ET32a-Fg.TPx原核表达质粒,重组蛋白得到高浓度表达,具有抗原性,为进一步研究其在大片吸虫病诊断中的应用奠定了基础。 相似文献
15.
为构建乙型脑炎病毒(JEV)SXBJ07株E基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达;根据JEV SXBJ07株基因组全序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增E基因全长;将目的基因插入pGEM-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET32α中,再转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后对其产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。结果表明:扩增到了全长为1 500 bp的JEV SXBJ株E蛋白基因;重组质粒pET-32α-E构建成功;融合蛋白可以与乙脑阳性血清抗体特异性结合。说明在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白。 相似文献
16.
根据GenBank已发表的猪Sar1b基因序列（GenBank登录号：AY819557）设计1对引物,以猪肝脏组织总RNA的反转录产物为扩增模板,用RT-PCR方法扩增出猪Sar1b基因cDNA全长编码区,经过EcoRI-SalI双酶切后定向克隆于pET28a原核表达载体,获得pET28a-Sar1b重组原核表达载体。将携带有重组原核表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）通过1 mmol/LITPG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大小大约为26 ku,与预期表达蛋白大小一致。Western blot检测显示该蛋白为His融合蛋白,表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白。猪Sar1b基因的克隆和表达研究,为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。 相似文献
17.
试验旨在对单增李斯特菌临床分离株（LM90SB2）的LPXTG基序表面蛋白lmo0331基因进行克隆、序列分析和原核表达。根据GenBank中lmo0331基因序列设计特异性引物,利用PCR方法扩增LM90SB2 lmo0331基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,测序后进行核苷酸序列和蛋白结构域分析;构建表达质粒pET32a-0331,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导后,利用SDS-PAGE和Western blotting检测重组蛋白。结果显示,LM90SB2 lmo0331基因核苷酸序列与NTSN株、F2365株、LL195株及WSLC 1033株的同源性均为100.0%,与N2306株、02-1792株、H34株的同源性均为99.9%。LM90SB2 lmo0331基因全长1 956 bp,ORF全长为1 857 bp,共编码618个氨基酸;蛋白结构域预测结果显示,lmo0331蛋白具有NEL、LRR、IR、PulA、LPXTG结构域。SDS-PAGE结果可见约88 ku重组蛋白带,Western blotting表明该蛋白可与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合。本研究成功构建了原核表达载体pET32a-0331,实现了lmo0331融合蛋白的表达,为进一步研究lmo0331基因的功能及单克隆抗体的制备奠定了基础。 相似文献
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克隆了猪瘟病毒(CSFV)石门株E2和Npro基因,并分别插入pGEX-6p-1表达载体中,构建了原核重组表达质粒。经IPTG诱导后,应用SDS-PAGE电泳检测结果表明,重组质粒均得以成功表达。使用超声法破碎菌体获得蛋白,将带有GST标签的融合蛋白进行亲和层析,其中E2和Npro的表达形式分别为包涵体表达和可溶性蛋白表达。将E2变性后重折叠,应用亲和层析法纯化蛋白,Western blot检测发现CSFV蛋白E2能够被CSFV阳性血清识别,具有良好的反应原性,而Npro不能与CSFV阳性血清反应。 相似文献
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克隆了猪瘟病毒（CSFV）石门株E2和Npro基因,并分别插入pGEX-6p-1表达载体中,构建了原核重组表达质粒。经IPTG诱导后,应用SDS-PAGE电泳检测结果表明,重组质粒均得以成功表达。使用超声法破碎菌体获得蛋白,将带有GST标签的融合蛋白进行亲和层析,其中E2和Npro的表达形式分别为包涵体表达和可溶性蛋白表达。将E2变性后重折叠,应用亲和层析法纯化蛋白,Western blot检测发现CSFV蛋白E2能够被CSFV阳性血清识别,具有良好的反应原性,而Npro不能与CSFV阳性血清反应。 相似文献
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ZHAO Tian-jing JIA Xiao-xiao SHI Qiao-yun GUO Shi-yu PANG Feng ZHU Hua-pei XU Kai-lian LI Ya-ying PENG Dong-mei LI Guo-hua WANG Feng-yang 《中国畜牧兽医》2015,42(9):2286-2291
This experiment was conducted to clone and express L1 gene of bovine papillomavirus genotype 13 (BPV13).Specific primers were designed according to the published sequences of BPV13, and 1 494 bp L1 gene fragment was amplified by PCR.After digestion by BamHⅠand Hind Ⅲ, the fragment was inserted into the prokaryotic expression vector pET28a(+) to construct the recombinant plasmid pET28a-L1.The recombinant plasmid pET28a-L1 was identified by double enzyme digestion and nucleotide sequencing, and was transformed into E.coli BL21(DE3).The expression of pET28a-L1 was induced by IPTG after selecting the best concentration and time.The results showed that L1 gene was exactly inserted into the prokaryotic expression vector pET28a(+), after induction, the target protein containing His-tag was successfully expressed by expression bacteria which included recombinant plasmid pET28a-L1;SDS-PAGE result showed that the molecular mass of the protein was 60 ku which was consistent with the expected size;After ultrasonic treatment, SDS-PAGE result showed that the protein existed in the precipitation;The target protein was a fusion protein with His-tag verified by Western blotting.This study laid a solid foundation for the research of function of BPV13 L1 gene and the development of effective DNA vaccine of BPV13. 相似文献