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采用RT-PCR方法,以家蚕cDNA为模板扩增天蚕素B(Cecropin B)基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pECFP-C1,构建CecropinB真核表达载体,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染奶山羊乳腺上皮细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的奶山羊乳腺上皮细胞系,用RT-PCR及琼脂糖扩散试验检测抗菌肽CecropinB基因及其表达活性。结果成功构建了pECFP-B真核表达载体,并建立了稳定转染的奶山羊乳腺上皮细胞系,成功地表达了目的基因,为进一步研究CecropinB的功能奠定良好的实验基础。 相似文献
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为了实现外源蛋白在动物乳腺中的特异性高效表达，利用山羊β-酪蛋白5’端1．132kb的侧翼调控序列、牛生长激素基因polyA(BGHPA)序列、基质结合区(matrixattac}linentregion，MAR)和多克隆住点(MCS)，构建了乳腺组织定位通用表达裁体pMRPA，鉴定正确后，将2．1kb的人组织型纤溶酶原激活荆(tissue—type plasminogen activator，tPA)cDNA克隆到pMRPA多克隆位点，获得重组表达载体pMRPA—tPA。在不同的泌乳时间，使用不同的包裹剂，采用不同的剂量，将pMRPA—tPA注入泌乳期山羊乳腺组织进行暂时表达。结果显示，所构建的乳腺组织特异性通用表达载体能够有效地指导目的基因的高效表达。通过乳腺暂时表达试验进一步发现，泌乳稳定期表达效果最好，tPA表达水平在2．020～6．959mg／L；表达量随DNA用量的增加而提高；使用普通包裹剂和裸质粒相比，普通包裹剂对表达效果无明显影响。本试验对乳腺暂时表达系统进行了系统性研究，为通过乳腺暂时表达系统改良乳汁蛋白组成提供了重要依据。 相似文献
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山羊BLG基因侧翼区的克隆及序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
克隆奶山羊β-乳球蛋白基因5′、3′调控区并对其进行序列分析。从徐淮奶山羊组织中提取基因组DNA,采用高保真长模板PCR法克隆得到山羊β-乳球蛋白基因4.2 kb的5′调控区和1.8 kb的3′调控区。将纯化后的PCR产物克隆到pGEM-TEasy载体中,经酶切鉴定和序列测定验证克隆的正确性。部分序列分析表明,5′区与GenBank中登录的山羊和绵羊BLG基因5′区同源性分别为100%和95%;3′区同源性则分别为99%和93%。克隆得到的奶山羊BLG调控区与山羊BLG伪基因显著不同,5′区和3′区同源性分别为83%和88%。结果表明,克隆得到的奶山羊BLG调控区可用于构建乳腺特异性表达载体,为指导外源基因在转基因动物乳腺中的高效表达奠定了基础。 相似文献
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家蝇抗菌肽天蚕素基因的定点突变和高效表达质粒的构建 总被引：3，自引：0，他引：3
运用反转录聚合酶链式反应 (RT PCR)技术从家蝇体内扩增出抗菌肽天蚕素 (cecropin)基因的开放阅读框(ORF) ,与pMD 18T载体重组 ,经限制性酶切片段分析和核苷酸序列分析 ,与GenBank中报道的序列一致。根据此ORF ,重新合成 1对引物 ,并在碳末端进行定点突变 ,加上Asn编码 ,使其末端酰氨化 ,再利用半嵌套式PCR扩增出家蝇cecropin基因的成熟肽 ,与双酶切的酵母表达载体pPICZαA连接 ,经PCR和双酶切鉴定 ,成功构建了分泌型表达质粒。 相似文献
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《畜牧兽医学报》2016,(9)
本研究旨在通过构建西农萨能奶山羊胰岛素诱导基因1(INSIG1)的重组腺病毒(Adenovirus,Ad)超表达载体,研究该基因超表达后对乳腺上皮细胞中脂质合成的影响,从而为该基因在山羊乳腺脂质合成调控中的功能研究奠定基础。根据GenBank(登录号:JQ665439)中山羊INSIG1基因序列设计引物,PCR扩增得到其CDS区序列。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV后获得pAdTrack-CMV-INSIG1质粒,将该质粒PmeⅠ线性化后转入大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组,获得pAdEasy-INSIG1重组腺病毒超表达载体。该重组质粒经PacⅠ线性化后转染293A细胞进行病毒的包装及扩繁,利用LaSRT法测定其滴度。将获得的重组腺病毒AdINSIG1感染山羊原代乳腺上皮细胞,利用实时荧光定量PCR检测INSIG1及脂质合成相关基因的mRNA表达情况,利用GPO-Trinder酶学反应检测细胞中甘油三酯的含量。结果表明,成功构建了奶山羊INSIG1基因重组腺病毒超表达载体,获得了具有较高滴度(2×108 U·mL-1)的超表达腺病毒Ad-INSIG1;Ad-INSIG1感染山羊原代乳腺上皮细胞48h后,与Ad-GFP组相比,INSIG1基因的mRNA表达量上调约500倍,固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)和SREBP裂解活化蛋白(SCAP)的mRNA表达量无明显变化,参与脂肪酸从头合成(ACCα、FASN)及去饱和(SCD1)基因的mRNA表达量均显著下降(P0.05);参与甘油三酯合成的3个关键基因中,GPAM及DGAT2的mRNA表达量显著下降(P0.05),AGPAT6的表达无显著变化;同时,催化甘油三酯分解(ATGL)的基因mRNA表达量也显著下降(P0.05);细胞内甘油三酯含量无显著变化。综上所述,在山羊原代乳腺上皮细胞中,INSIG1能够抑制脂质合成相关基因的表达,对山羊乳腺脂质合成具有调控作用。 相似文献
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奶牛气管抗菌肽是一种具有较强抗菌活性的抗菌小肽。实验从奶牛气管组织中提取总RNA,反转录成c DNA,以此为模板,用奶牛气管抗菌肽特异性PCR引物扩增奶牛气管抗菌肽基因,然后将其连入载体p CMV-C-e GFP中构建奶牛气管抗菌肽的真核表达载体b TAP-GFP,并将此载体转染进奶牛乳腺上皮细胞中,分别运用荧光蛋白观察和细菌记数等方法检测b TAP-GFP蛋白在细胞中的表达及其对大肠杆菌的抗菌活性。试验结果表明,试验成功的建立了奶牛气管抗菌肽的真核表达载体b TAP-GFP,并且此重组载体能在奶牛乳腺上皮细胞中正常表达具有抗大肠杆菌活性的b TAP-GFP蛋白。 相似文献
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为了建立通过山羊乳汁获取甜味蛋白Brazzein的方法,研究在人工合成甜味蛋白Brazzein基因的基础上,利用乳腺特异表达的pBC-1载体,构建Brazzein基因的真核表达载体。结果表明:所合成的Brazzein基因与GenBank中Brazzein序列的同源性为100%,构建的克隆载体STP-pMD18-Simple正确;将甜味蛋白Brazzein基因与pBC-1载体连接后,成功构建甜味蛋白Brazzein基因的乳腺特异性表达载体STP-pBC-1。 相似文献
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近年来，乳蛋白基因在乳腺组织的高效、特异性表达的调节机制是人们研究的热点。随着研究的不断深入，其调控序列的结构已日渐清楚，而利用其调控序列构建乳腺特异性表达载体也成为人们关注的焦点。现就乳蛋白基因的表达调控及应用其构建乳腺生物反应器表达载体的研究概况作一综述。 相似文献
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构建FMDV 2A介导的人白细胞介素2基因(hIL-2)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子乳腺特异性表达载体,并验证其在乳腺上皮细胞中的表达.克隆奶山羊β-酪蛋白启动子序列,将hIL-2基因序列置于启动子之后,然后利用口蹄疫病毒2A(FMDV 2A)自剪切序列连接EGFP基因,构建出乳腺特异性的双顺反子表达载体pFIENβ,并利用脂质体转染山羊乳腺上皮细胞,然后用RT-PCR技术和Western blot检测hIL-2基因与EGFP基因的表达.重组质粒pFIENβ经酶切鉴定后表明构建成功,转染质粒PFIENβ和pEGFP-C1的细胞均观察到绿色荧光;从转染pFIENβ的乳腺上皮细胞中扩增出hIL-2基因和EGFP基因,而转染pEGFP-C1的细胞中只扩增出EGFP基因;经Western blot检测,转染pFIENβ的细胞中均表达了hIL-2和EGFP蛋白.结果表明山羊β-酪蛋白启动子能同时启动hIL-2基因和EGFP基因在山羊乳腺上皮细胞中的表达,并且利用FMDV 2A元件实现了hIL-2基因和EGFP基因的非融合型表达. 相似文献
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魏静 《四川畜牧兽医学院学报》2009,(4):28-32
在现代法律秩序中,商会自治规范是制定法的基础和必要的补充,甚至在某些方面替代了制定法;商会自治规范主要包括商会组织规范、行为规范、惩罚规范以及争端解决规范等;其效力仅及于其内部成员;商会自治规范和制定法之间存在冲突,但也存在整合的基础。 相似文献
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以国际标准强毒Ｒ株人工感染非免疫产蛋鸡,定时扑杀,分别从鼻窦、眶下孔、气管、肺、气囊、卵巢和输卵管分离ＭＧ,并收集感染鸡所产蛋分离ＭＧ。结果表明,人工感染４８小时后上、下呼吸道及肺已被全面感染,９６小时气囊已被感染,１２０小时输卵管已能分离到ＭＧ,卵巢始终分离不到ＭＧ。人工感染鸡自１４４小时便能在其所产蛋中分离出ＭＧ。药物治疗能在７２小时内消除感染,油乳剂苗则需２４天后逐渐降低蛋内ＭＧ分离率,药物卵内注射、种蛋药浴、高温处理均能杀死卵内ＭＧ,但以研制的种蛋浸泡剂药浴效果为最好。 相似文献
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本文概述了猪的毛色类型、猪的毛色遗传模式,着重综述了猪毛色基因分子基础的研究进展,指出存在问题并就未来发展方向做了思考。 相似文献
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REASONS FOR PERFORMING STUDY: Centesis of the bicipital bursa using an 8.9 cm long spinal needle has been reported but the alternative of employing a 3.8 cm long hypodermic needle requires validation. OBJECTIVE: To compare the efficacy of 2 different methods of centesis of the bicipital bursa and to evaluate the usefulness of ultrasonographic imaging to determine the location of solution administered when centesis of the bursa is attempted. METHODS: For Trial 1, 6 clinicians, who had no previous experience of centesis of the bicipital bursa, attempted to inject a solution composed of an aqueous radiopaque contrast medium and physiological saline solution (PSS) into the bicipital bursae of 2/12 horses using the previously described distal approach to inject one bursa and a proximal approach to inject the contralateral bursa. The bicipital tendon and bursa were examined ultrasonographically before and after injection; and both shoulders were examined radiographically to identify the location of the medium. In Trial 2, another 6 clinicians, also with no previous experience of centesis, repeated Trial 1, using 6 horses, but the radiopaque contrast medium was mixed with air instead of PSS. RESULTS: Accuracy of centesis using the proximal approach was 39% and that of the distal approach 28%. Ultrasonographic examination of the shoulder allowed the location of solution and air to be accurately predicted in all 12 shoulders examined. CONCLUSIONS: Clinicians who have had no previous experience performing centesis of the bicipital bursa are unlikely to be successful in centesis using either approach. Radiographic examination after injecting a radiopaque contrast medium may be necessary to assess the success of centesis especially if bursal fluid is not obtained during centesis. Injecting air along with the radiopaque contrast medium provides more accurate ultrasonographic confirmation of centesis and better radiographic definition than does injection without air. 相似文献
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