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根据已发表的天蚕素B的cDNA序列化学合成4务引物,以重叠延伸PCR的方法合成了真核细胞偏爱密码子编码的抗菌肽天蚕素B基因,将其克隆于pMD18-T栽体,DNA序列分析证实合成的抗菌肽基因的碱基序列与设计的序列完全一致.利用山羊-β酪蛋白基因5'侧翼调控序列和真核基因表达栽体plRES1-neo,构建抗菌肽天蚕素B的乳腺组织特异性表达载体pbCP-cpin,将该载体溶于生理盐水,注入处于泌乳期的成年母山羊乳腺组织进行暂时表达.通过对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌试验确定了抗菌肽天蚕素B基因在山羊乳腺中的表达和抗菌活性.本试验建立了抗菌肽天蚕素B的乳腺瞬时表达系统,为验证各调控元件以及抗菌肽基因在转基因动物乳汁中分泌表达的有效性和可行性提供了一个快速检测系统. 相似文献
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在枯草芽孢杆菌中表达抗菌肽Abaecin,并鉴定表达产物的生物学活性,以判定其能否开发为口服药物和饲料添加剂。通过Western blot方法检测目的基因表达情况;采用琼脂扩散法检测表达产物的生物活性。结果表明:抗菌肽Abaecin在枯草芽孢杆菌中成功表达,并有效地分泌至细胞外。体外抑菌实验结果表明,表达产物Abaecin对革兰氏阴性菌有抑菌活性,并且在不同温度37～100℃、pH2～9和酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K)的条件下,仍能保持抗菌活性,证实表达产物可以抵抗动物消化系统的降解。枯草芽孢杆菌简便快捷地表达了抗菌肽Abaecin,并且表达产物有开发为口服药物和饲料添加剂的前景。 相似文献
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根据大肠杆菌的密码子偏好性,人工设计并合成了3条抗菌肽Cecropin P1基因寡核苷酸片段,通过PCR扩增得到抗菌肽Cecropin P1基因,将此基因克隆到原核表达载体pMAL-p2X中,然后将重组质粒pMAL-p2X-Cecropin P1转化E.coliTB1,经IPTG诱导进行融合表达,以Amylose Resin亲和层析纯化。通过SDS-PAGE分析,融合蛋白MBP-Cecropin P1表达与纯化成功。抗菌肽Cecropin P1基因的成功表达为进一步研究其抗菌活性、抗菌机理及应用研究打下基础。 相似文献
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为获得猪蛔虫抗菌肽Cecropin P2基因并研究其抗菌功能,根据CecropinP2成熟肽的编码基因,人工合成3条寡聚核苷酸片段,经PCR获取Cecropin P2基因序列,成功构建了重组表达质粒pPIC9 K-Cecropin P2-His6并转化毕赤酵母GS115感受态细胞。转化子经MD、MM以及G418筛选,1%甲醇诱导表达,利用Tris tricine-SDS-PAGE对表达产物进行检测。体外抑菌试验表明,获得的重组蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抑菌活性。本试验为抗菌肽的应用和新抗菌肽类药物的开发提供了必要的试验基础。 相似文献
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奶牛气管抗菌肽是一种具有较强抗菌活性的抗菌小肽。实验从奶牛气管组织中提取总RNA,反转录成c DNA,以此为模板,用奶牛气管抗菌肽特异性PCR引物扩增奶牛气管抗菌肽基因,然后将其连入载体p CMV-C-e GFP中构建奶牛气管抗菌肽的真核表达载体b TAP-GFP,并将此载体转染进奶牛乳腺上皮细胞中,分别运用荧光蛋白观察和细菌记数等方法检测b TAP-GFP蛋白在细胞中的表达及其对大肠杆菌的抗菌活性。试验结果表明,试验成功的建立了奶牛气管抗菌肽的真核表达载体b TAP-GFP,并且此重组载体能在奶牛乳腺上皮细胞中正常表达具有抗大肠杆菌活性的b TAP-GFP蛋白。 相似文献
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蚕类抗菌肽及其研究进展 总被引：5，自引：0，他引：5
抗菌活性肽被认为是从细菌到高等哺乳动物都普遍存在的一类防御性多肽。被称之为“第二防御体系”，具有抗细菌、真菌、病毒、原虫及抑癌活性，有潜在的应用价值。近年来。对抗菌肽的研充已成为一个迅速发展的新领域，越来越引起人们的关注和重视。本介绍蚕类抗菌肽的种类、作用机理、生物活性、抗菌肽基因的分子设计、克隆与表达以及抗菌肽在转基因动植物方面的研究状况。并探讨了抗菌肽的应用前景及存在的问题。 相似文献
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家蚕抗菌肽moricin在大肠杆菌中的融合表达及抗菌活性测定 总被引：3，自引：1，他引：2
Moricin是家蚕中发现的一种抗菌肽,对革兰氏阴性和阳性菌都有较强的抗菌活性,具有良好的开发应用前景。为了建立一种大量表达和快速分离moricin的方法,采用PCR拼接法获得moricin基因后重组到表达载体pET-32M上,并在大肠杆菌(E.coli)中融合表达。表达产物存在于上清中为可溶状态,经Ni-NTA柱纯化获得融合蛋白,再经凝血酶(thrombin)酶切后过2次Ni-NTA柱获得纯度为90%以上的moricin,液相测定法表明纯化获得的moricin对大肠杆菌具有抗菌活性。 相似文献
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抗菌肽是生物体产生的一种具有抗菌活性的小分子肽,具有天然的抗菌活性.目前,基因重组的方法是获得大量抗菌肽最经济的方法.本文就抗菌肽基因表达系统作一综述,包括大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统等. 相似文献
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本文旨在对牛气管抗菌肽(tracheal antimicrobial peptide,TAP)基因进行原核表达,以及研究重组蛋白的抗菌活性,并分析TAP在各组织的表达分布情况,为开展转TAP基因抗乳腺炎奶牛研究提供技术资料。作者采用RT-PCR从荷斯坦奶牛气管扩增TAP基因,分析其序列后根据大肠杆菌表达系统对密码子的偏好性,人工合成牛TAP基因,构建pET32a(+)-TAP重组质粒;然后转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并纯化。对表达蛋白进行SDS-PAGE、Western Blot鉴定;在线软件分析目的蛋白表达量。采用滤纸片法测定重组牛TAP的体外抗菌活性,并用RT-PCR法分析牛各组织中TAP表达情况。测序结果表明,扩增到114bp目的基因片段,可编码含38个氨基酸残基的成熟蛋白。SDS-PAGE分析表达的融合蛋白相对分子质量为24ku,重组蛋白以可溶性方式存在,表达量占菌体总蛋白的52.1%。Western Blot检测只出现单一条带。抗菌效价分析表明0.115μg·μL-1重组蛋白对牛源金黄色葡萄球菌有一定的抗菌活性。TAP基因在奶牛咽喉、肺、气管、小肠、肝、心脏及口腔黏膜中均有表达,在鼻黏膜和舌黏膜中微量表达,在皮肤中几乎不表达。作者成功表达了牛TAP基因,重组牛TAP蛋白在大肠杆菌中实现高效表达,并具有一定的抗奶牛乳腺炎致病菌的活性,为未来培育抗乳腺炎转基因奶牛及相关基因工程产品的开发奠定了基础。 相似文献
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牛蛙(Rana catesbeiana)蛙皮抗菌肽基因的克隆、测序及其表达 总被引：2，自引：3，他引：2
利用RT—PCR的方法从牛蛙皮肤组织中克隆到大小为270bp的片段RCABP，将其克隆到pGEM—T载体，测序获得1个新的碱基序列。将此基因克隆到原核表达载体pQE一80L，获得融合表达质粒pQE一80L／DHFR／ABP，在1％IPTG诱导下进行表达。SDS—PAGE检测表明，重组蛙皮抗菌肽蛋白的表达量占菌体总蛋白的24％，以包涵体形式存在。体外抑菌试验表明，所构建的质粒能在大肠杆菌中表达具有体外抑菌活性的蛙皮抗菌肽，该融合蛋白具有良好的应用前景。 相似文献
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本研究旨在探究大熊猫西氏贝蛔虫一个抗菌肽分子的生物学特性及其重组蛋白rBsABF在体外的抗菌活性。对西氏贝蛔虫抗菌肽BsABF基因进行克隆、原核表达及重组蛋白rBsABF的纯化,通过免疫印迹与荧光免疫组化分析重组蛋白rBsABF免疫反应性及BsABF在虫体中的分布;采用抗菌试验对重组蛋白rBsABF的抗菌活性进行了初步评价。研究结果显示,BsABF基因ORF全长276bp,编码蛋白分子大小为10.01ku,带有N端信号肽,与猪蛔虫同源基因序列相似性为94%,主要分布于虫体体壁、肠道与虫卵,重组蛋白rBsABF具有良好的免疫反应性。抗菌试验结果显示该重组蛋白对大熊猫源粪肠球菌及大肠杆菌具有一定的抗菌活性。首次鉴定了大熊猫西氏贝蛔虫BsABF基因,抑菌试验表明重组蛋白rBsABF具有抗菌活性,为今后深入研究该蛋白的功能特性奠定了基础。 相似文献
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家蚕防御素(defensin)是家蚕抗菌肽家族的主要成员之一,为家蚕先天性免疫的重要效应因子。采用生物信息学方法分析家蚕防御素基因BmdefA、BmdefB的序列中各有2个外显子,2个基因分别定位于家蚕第4号和第13号染色体上;等电点预测BmdefA带有负电荷,属于罕见的阴离子型抗菌肽,而BmdefB带有正电荷,属于常见的阳离子型抗菌肽;预测2个基因编码的成熟肽分子质量均在4 kD左右。用RT-PCR方法检测BmdefA在家蚕整个发育过程中有表达,且在检测的幼虫和成虫各组织中均有表达;BmdefB从幼虫5龄第3天到成虫期表达,雄性表达量高于雌性,且在5龄第3天幼虫的生殖腺、脂肪体和血细胞中高水平表达。家蚕防御素BmdefA、BmdefB具有不同的分子特性和表达特征,暗示它们在家蚕先天免疫过程中可能行使不同的功能,甚至可能具有不同的抗菌机理。构建融合GST标签的家蚕防御素基因原核表达载体,通过在大肠杆菌细胞内诱导表达,获得可溶性的目的蛋白,使用GST亲和层析柱初步纯化表达的融合蛋白并进行Western blotting鉴定,为进一步研究BmdefA、BmdefB的体外活性和抑菌机制奠定基础。 相似文献
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抗菌肽基因表达系统研究进展 总被引：1，自引：0，他引：1
抗菌肽是生物体产生的一种阳离子短肽,具有天然的抗菌活性。由于抗菌肽具有与传统抗生素不同的作用机制,不产生耐药性,因而具有重要的临床应用价值,可作为新型绿色、安全、环保的饲料添加剂。但是怎样用廉价的方式大量地得到抗菌肽是对它进行深入研究和广泛应用的前提,基因重组的方法可能是最经济的获得大量抗菌肽的方法,许多研究对不同来源的抗菌肽进行了重组表达的尝试,涉及的表达系统包括大肠杆菌系统、酵母系统、昆虫系统。针对近年来抗菌肽开发的基因工程策略和实践,尤其是大肠杆菌表达系统和酵母表达系统,文中进行了简要综述。 相似文献
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为利用大肠杆菌表达系统高效表达抗菌肽Thanatin并避免其抗菌活性对宿主菌的影响,将抗菌肽Thanatin基因与家蚕核型多角体病毒多角体蛋白Polyhedrin基因融合克隆到表达载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a(+)-Thanatin-polyhedrin,转化大肠杆菌BL21(DE3)中表达。SDS-PAGE检测显示经诱导表达的菌体中有与融合蛋白理论值(35 kD)相符的目的条带。凝胶扫描分析目的融合蛋白以包涵体的形式表达,且诱导后6 h融合蛋白的表达量最大,约占菌体总蛋白量的30%。纯化融合蛋白用盐酸羟胺切割后初步纯化获得具有抗菌活性的Thanatin蛋白。研究结果表明家蚕核型多角体病毒多角体蛋白能够作为抗菌肽Thanatin融合标签介导其高水平表达,有助于利用基因工程技术大规模生产抗菌肽Thanatin。 相似文献
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为了获得抗菌活性较强的抗菌肽，将蜂毒肽（Melittin）与贻贝素B （Mytilin-B）的核心功能序列杂合，以Melittin （3-14）和Mytilin-B （13-27）的成熟肽段作为模板序列，根据巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）偏好密码子，采用SOE方法合成杂合抗菌肽Mel-MytB（MEM）基因。改造后的基因克隆到pPICZα-A质粒，构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-MEM，而后经Sac Ⅰ酶切线性化后电转入毕赤酵母受体菌X-33。结果表明，在醇氧化酶（AOX）启动子调控下，分子质量约3.0 ku的Mel-MytB杂合抗菌肽获得表达，具有热稳定性和酸稳定性，煮沸40 min、pH 2.0~10.0范围内抑菌活性基本不变。抗菌特性研究结果表明，该表达产物具有广谱抗菌活性，其对大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923/ATCC6538、肠道沙门氏菌ATCC13076、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、副溶血弧菌ATCC17802、创伤弧菌ATCC27562、枯草芽孢杆菌ATCC6633的MIC值分别为5.1、2.2、2.0、4.6、7.6、9.4、13.2和59.4 μg/mL。因此，重组抗菌肽Mel-MytB在疾病防治和动物饲料添加剂等方面具备较好的应用前景。 相似文献
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利用毕赤酵母表达系统表达新型家蝇抗菌肽MDAP-2基因(Musca domestica antimicrobial peptide,MDAP-2),为其作为新型抗菌物质应用于临床提供实验依据。根据已有的MDAP-2的氨基酸序列,采用PCR技术扩增获得MDAP-2基因,构建真核重组表达质粒pPIC9K-MDAP-2,将线性化的重组质粒电击转入毕赤酵母(P.pastoris)感受态GS115细胞内,将PCR鉴定为阳性的重组酵母菌进行甲醇诱导表达,并采用Tricine-SDS-PGAE检测表达产物的大小,经镍柱亲和层析纯化获得纯度较高的重组蛋白,采用管碟法检测重组蛋白的生物学活性。结果显示,重组质粒pPIC9K-MDAP-2获得高效表达,蛋白分子量为7.8 kD,管碟法检测重组蛋白对大肠杆菌与沙门氏菌均具有体外抑菌活性。MDAP-2基因的成功表达为进一步研究表达产物的生物学及免疫学活性奠定基础。 相似文献