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基于tlh基因病原副溶血弧菌LAMP检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为了研究副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)的快速分子生物学检测方法,试验以副溶血弧菌特异性tlh基因为分子靶标设计引物,利用环介导恒温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立病原副溶血弧菌的快速检测方法。结果表明:特异性检测仅副溶血弧菌基因组DNA可扩增出阶梯状条带,且反应产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ后呈现明显的绿色阳性反应;而鳗弧菌、河口弧菌、美人鱼弧菌、霍乱弧菌、哈氏弧菌、鱼肠道弧菌这6种对照病原菌均未出现任何扩增条带,且反应产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ后呈现橙色阴性反应;灵敏度检测的最低检测限为42 cfu/mL;对人工染菌的9种水产品检测均可获得阳性扩增结果;该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需1 h左右,较传统方法操作简单、耗时短、不需昂贵仪器。说明该方法可用于针对副溶血弧菌的进出口检验检疫、食品安全检测及由该菌引起的水产动物疾病的诊断与分子流行病学调查。 相似文献
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贝类中副溶血弧菌和沙门氏菌荧光定量PCR快速检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
为适应进口鲜活水产品的快速检验,有必要建立快速检测多种病原生物的方法。本文针对鲜活水产品中常见的副溶血弧菌和沙门氏菌,设计了特异的荧光引物,建立了检测贝类中这两种细菌的荧光定量PCR体系,并进行了特异性与重复性试验。结果表明,在相同的反应条件下,副溶血弧菌和沙门氏菌均得到了特异性扩增,而阴性对照菌株均未见扩增。副溶血弧菌标准曲线在1.53×105~1.53×109拷贝/μL之间、沙门氏菌标准曲线在4.89×106~4.89×1010拷贝/μL之间有较好的线性关系。与传统的检测方法相比较,该荧光定量PCR方法检测贝类中的副溶血弧菌和沙门氏菌更为快速准确,结果直观,可以满足口岸进口水产品快速检测的需要。 相似文献
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依赖于核酸序列恒温扩增技术快速检测副溶血性弧菌方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
为建立副溶血性弧菌的快速检测方法,本研究采用依赖于核酸序列恒温扩增(NASBA)技术,以副溶血性弧菌的tlh基因为扩增的靶基因设计特异性引物和探针,建立可快速扩增副溶血性弧菌的NASBA方法.特异性和灵敏度试验结果表明:该NASBA方法对副溶血性弧菌的最小检出量为5.1×102 cfu/mL,高于普通PCR方法,而且与其他种属的菌无任何交叉反应.此外,本研究将副溶血弧菌扩增产物采用通用型核酸扩增物快速检测板进行检测,实现了特异性强的快速副溶血弧菌的检测.该方法对仪器要求低,具有良好的应用前景. 相似文献
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为建立副溶血弧菌快速检测方法,本研究以副溶血弧菌不耐热溶血素(tlh)基因作为靶序列设计特异性引物,经反应条件优化建立了检测副溶血弧菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)方法.优化试验结果显示该方法在37℃和35 min条件下检测效果最佳;特异性试验结果显示,该方法除对副溶血弧菌的检测结果为阳性外,对其余8种常见的弧菌检测结果... 相似文献
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实时荧光PCR快速检测水产品中副溶血性弧菌的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
目的建立快速检测水产品中副溶血性弧茵的实时荧光PCR方法。方法利用副溶血性孤菌TDH基因的保守序列设计引物和探针,建立快速检测副溶血性弧菌的实时荧光PCR方法。结果本研究建立的检测副溶血性弧菌的实时荧光PCR方法,其纯茵检测低限低于10cfu/PCR反应体系;对模拟阳性样品直接检测,检测低限为10~3cfu/g。模拟样品经增茵培养4～6h后,检测低限达1cfu/g;用本法对24株标准菌株/参考菌株进行检测,结果除副溶血性弧菌呈阳性外,其他23株非副溶血性弧菌均呈阴性反应;重复性试验结果:批内和批间变异系数均小于1%。结论本研究建立的副溶血性弧菌实时荧光PCR方法具有快速、灵敏、特异和重复性好的优点,可在8h内对水产品中的副溶血性弧菌进行定性或定量检测。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2016,(1)
霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌是引起全球范围的食源性疾病的重要病原菌,建立一种能准确鉴别这3种弧菌的方法具有重要意义。groEL基因是包括弧菌属在内的多种细菌检测的分子标记。本研究根据3种弧菌的groEL基因分别设计引物,经PCR扩增及反应条件的优化,建立一种能同时检测这3种弧菌的多重PCR方法。结果表明应用多重PCR技术对霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌能分别特异性地扩增出418、644、192 bp的目的片段。检测其他非目标供试菌时,不出现任何扩增条带。敏感性检测结果表明,对霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌最低检测限分别为102、102、103CFU/m L。人工染菌水产品检测结果显示,所建立的多重PCR方法能够有效检测出目的细菌,而未染菌组均为阴性。本文通过建立的多重PCR方法实现了对这3种弧菌的同时检测,具有快速、灵敏度高和特异性强等优点,对水产品中这3种弧菌的检测和流行病学调查具有重要意义。 相似文献
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为了研究副溶血弧菌双重PCR检测方法,试验采用tlh和toxR基因序列设计2对特异性引物进行双重PCR检测,扩增出450 bp和368 bp目的片段。结果表明:在同一PCR反应体系中仅副溶血弧菌可同时扩增出2种基因片段,4株对照菌无任何扩增条带;该双重PCR检测方法最低能检测1.660 7×103cfu/mL菌体浓度的副溶血弧菌。说明试验所建立的双重PCR检测方法特异性强、敏感性高、方法简单、用时短,可用于副溶血弧菌引起的水产动物疾病的诊断与分子流行病学调查。 相似文献
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基于toxR基因的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测病原副溶血弧菌方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
基于副溶血弧菌toxR基因保守序列设计1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测副溶血弧菌的方法。常规PCR检测,副溶血弧菌扩增出大小为368bp的目的片段,其他4种病原细菌均为阴性;SYBRGreenⅠ实时定量PCR扩增曲线反映了PCR的指数增长阶段和平台阶段;在Tm为85℃,扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体;所制作的标准曲线在2.7×108～2.7×102拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.998,能对副溶血弧菌进行准确的定量分析;该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需4～5h,较传统方法敏感、操作简单,耗时短,是副溶血弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及食品中针对副溶血弧菌安全检测的有效手段。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2015,(6)
根据副溶血弧菌种特异性基因(tox R)、耐热直接溶血素基因(tdh)和相对耐热直接溶血素基因(trh)为靶基因分别设计引物,进行PCR扩增及反应条件的优化,建立了检测含有溶血素毒力基因的致病性副溶血弧菌的多重PCR方法。3对引物能分别特异性地扩增出368、269、486 bp的目的片段。副溶血弧菌均能扩增出tox R基因,不含溶血素基因的菌株(tdh-/trh-)仅扩增出1条目的片段,而含不同溶血素基因的致病性副溶血弧菌则分别扩增出2条(tdh+/trh-或tdh-/trh+)和3条(tdh+/trh+)特异性条带。检测其他非副溶血弧菌的供试菌,则不出现任何扩增条带。人工模拟样品检测结果显示对致病性副溶血弧菌的最低检测浓度为103CFU/m L。结果表明该多重PCR检测方法具有较好的特异性和灵敏性,对检测致病性副溶血弧菌有重要意义。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2018,(5)
本研究选用硝酸纤维素膜作固相载体,以出现明显清晰斑点者判为阳性结果,成功建立了检测致病性副溶血弧菌耐热直接溶血素(direct heat hemolysin,TDH)的斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)方法。根据棋盘试验,确定免疫血清最佳工作浓度为1:100,酶标二抗最佳工作浓度为1:1000。特异性检测结果表明,TDH阳性的副溶血弧菌可以呈现明显清晰斑点,而不能产生TDH的副溶血弧菌及其他对照菌(如嗜水气单胞菌、大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌)均无斑点显示。该方法与PCR方法的符合率为82.5%。本研究所建立的Dot-ELISA检测方法简便、快速,特异性和敏感性较高,适合基层和现场的初步筛选。 相似文献
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贝类折光马尔太虫PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据基因库中折光马尔太虫的基因保守序列,设计了1对特异性引物,通过对PCR扩增条件的优化,研究建立了检测贝类折光马尔太虫的PCR方法。该方法对折光马尔太虫模板进行扩增,得到与试验设计相符的478 bp的特异性扩增带,而对派琴虫、单孢子虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌等病原体的扩增,结果全为阴性。敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到1 pg的折光马尔太虫DNA。用该PCR对广西沿海的119份牡蛎病料进行检测,折光马尔太虫的阳性率为1.68%,结果提示了中国南方沿海的养殖贝类中存在折光马尔太虫的感染,建立的PCR方法可以用于贝类折光马尔太虫的临床快速检测。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(11):1875-1881
为建立创伤弧菌和副溶血弧菌的双重环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,本试验以创伤弧菌metalloprotease基因和副溶血弧菌ompA基因为靶点设计LAMP扩增引物,并在内引物间添加不同的酶切位点,通过对反应时间和温度的优化及酶切反应,成功建立了双重LAMP检测方法,并对其检测特异性、灵敏度和实际应用性进行了研究。结果显示,62℃反应45min时可同时检测到2种弧菌的存在,通过限制性内切酶酶切,可准确区分2种弧菌。该方法比普通PCR检测方法灵敏度高102~103倍。选择17株细菌菌株作为检测模板,发现除创伤弧菌和副溶血弧菌反应结果呈阳性外,其他均为阴性。以大菱鲆作为实验动物,检测双重LAMP技术的实际应用可能,该方法可准确检测并鉴定出组织和血液中感染的细菌种类,其灵敏度可达374~410CFU/g(mL)。SYBR GreenⅠ是一种结合于DNA双链小沟中的荧光染料,反应产物加入该染料后,极易用肉眼判别。本试验成功建立了创伤弧菌和副溶血弧菌的双重LAMP检测方法,该方法可用于水产养殖中病原菌的早期诊断。 相似文献
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为快速检测食品中的金黄色葡萄球菌(SA)、单增李斯特氏菌(LM)和副溶血性弧菌(VP),根据各菌的相关基因设计引物,分别扩增金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因-nuc、单增李斯特氏菌溶血素O上的hlyA基因和副溶血性弧菌的热稳定直接溶血素基因-tdh,建立一种MPCR快速检测食品中致病菌的方法,结果表明,三条特异性扩增片段分别为279bp、243bp和202bp,经DNA测序证明其序列与模板被扩增片段一致。该方法具有良好的灵敏性和特异性。 相似文献
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为了明确副溶血弧菌在内陆淡水水体中的分布情况，本试验从查干湖水体中分离得到1株革兰阴性杆菌，命名为A201805S2,对其进行形态观察、生理生化鉴定，并利用PCR方法对其16S rDNA基因序列进行扩增和测序，将测得结果于NCBI上进行BLAST同源性比较。结果显示，该菌株在硫化硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(TCBS)上为绿色菌落，革兰染色呈红色，两端钝圆，为革兰阴性杆菌；生理生化鉴定结果与副溶血弧菌特性相一致；分离菌与副溶血弧菌16S rDNA基因序列同源性达99%。结果表明，本试验首次从内陆苏打盐碱型淡水水体中分离出副溶血弧菌，为淡水水体副溶血弧菌防控提供数据支持。 相似文献
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根据Genbank中折光马尔太虫的基因保守序列,设计了3条特异性引物,通过对半套式PCR扩增条件的优化,研究建立了检测贝类折光马尔太虫的半套式PCR方法.该方法对折光马尔太虫模板进行扩增,得到与实验设计相符的228 bp的特异性扩增带,而对单孢子虫、派琴虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌等病原体的扩增,结果全为阴性.敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到0.01 fg的折光马尔太虫质粒DNA.用该半套式PCR对福建沿海的贝类样品进行检测,结果从溢蛏中检出折光马尔太虫7份,结果提示福建沿海养殖的贝类中存在折光马尔太虫感染,建立的半套式PCR方法可以用于贝类折光马尔太虫的临床快速检测. 相似文献
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《中国动物传染病学报》2015,(6)
副溶血弧菌是引起细菌性食物中毒的主要食源性致病菌,耐热直接溶血毒素(theromostable direct hemolysin,TDH)是其公认的主要致病因子。本研究根据已发表基因序列(Gen Bank登录号:M10069)设计引物,以副溶血弧菌SHJLA株基因组DNA为模板,扩增编码TDH蛋白的基因,克隆至表达质粒p ET28a(+)中,重组质粒经限制性酶切鉴定后测序,结果表明插入片段长度为576 bp。重组原核表达质粒p ET28a-tdh转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经诱导可表达分子量约为27 k Da的融合蛋白,主要以包涵体形式表达。对包涵体进行复性,Western blot分析表明经过复性后的重组蛋白能够被感染副溶血弧菌SHJLA株的小鼠血清识别。重组蛋白免疫家兔,ELISA检测多抗血清效价在1:256 000以上。将该多抗初步应用于斑点-ELISA(DotELISA)方法的建立,TDH阳性的致病性副溶血弧菌检测到阳性斑点,而TDH阴性的副溶血弧菌及其他细菌未检测到特异性斑点。本研究可为深入研究TDH的蛋白功能,建立致病性副溶血弧菌免疫学快速诊断方法以及保护性疫苗的研制提供研究基础。 相似文献