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1.
《中国兽医杂志》2017,(7)
为了同步检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因1型和基因2型并能够加以区分,根据Gen Bank中已发表的BVDV基因1型和基因2型、牛蓝舌病病毒(BTV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的全基因序列,采用Primer Premier 5.0软件,针对BVDV的高度保守的5'端非编码区的核苷酸序列,设计了两对特异性引物,二重RT-PCR方法扩增目的片段的大小分别为222 bp和119 bp,经过对反应体系和条件的优化,本研究建立了在同一反应体系中鉴别检测BVDV基因1型和2型的RT-PCR方法,扩增出了与预期大小相符的目的片段。该方法便捷,特异性高,敏感性强,重复性好,可作为BVDV分型鉴定和快速诊断的有效方法。 相似文献
2.
根据GenBank中登录的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′UTR基因序列,设计合成了1对特异性引物,建立了BVDV的RT-PCR检测方法。该方法从BVDV标准毒株NADL中扩增出了279bp的特异性片段,而对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒、MDBK细胞等的扩增结果均为阴性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达10-1×TCID50。提取9份细胞毒总RNA后,进行一步法RT-PCR扩增可获得一致的检测结果,说明该方法重复性很好。应用该方法对45份临床疑似患牛的样品进行检测,结果检出4份阳性,表明该方法具有较好的临床应用性,且检测结果与参考实验室检测结果完全相符,可用于BVDV的快速诊断。 相似文献
3.
BPIV-3和BVDV双重RT-PCR快速检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
参照GenBank中登录的牛副流感病毒3型(BPIV-3)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)全基因序列,分别针对BPIV3特异性NP蛋白保守基因和BVDV保守区段E2基因设计2对引物,经优化反应条件建立了快速鉴别BPIV-3和BVDV的双重RT-PCR诊断方法。最佳扩增条件为94℃30s,56.2℃30s,72℃1min,循环30次;72℃延伸5min,16℃10min;BVDV引物浓度为1.0μmol/L,BPIV-3引物浓度为0.5μmol/L。采用该方法检测BPIV-3和BVDV参考病毒株,能同时扩增出预期为425bp和294bp大小的特异性片段,而扩增牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、猪瘟病毒以及牛支原体、致病性大肠埃希菌、多杀性巴氏杆菌A型、化脓隐秘杆菌和鼠伤寒沙门菌等均呈阴性反应。对参考病毒株进行梯度稀释检测,结果证明该方法检测BPIV-3的灵敏度可达10-3 TCID50/0.1mL,而BVDV的灵敏度达102 TCID50/0.1mL。 相似文献
4.
牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及应用 总被引：1，自引：1，他引：0
根据GenBank中登录的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因序列,设计合成了1对特异性引物,建立了检测BVDV的RT-PCR方法。通过对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,结果显示,该方法可从BVDV标准毒株Oregon C24V中扩增出471 bp的特异性片段,而对猪瘟病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒、MDBK正常细胞的扩增结果均为阴性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达10-1 TCID50/mL。应用该方法对临床腹泻病牛各脏器样品进行检测,结果比病毒分离方法更为敏感,操作简便。表明建立的RT-PCR方法具有特异、灵敏、高效、快速的特点,可用于BVDV的临床检测及流行病学监测。 相似文献
5.
6.
为建立一种快速检测1型、2型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的通用RT-PCR方法,根据GenBank上收录的64株1型、2型BVDV以及1株猪瘟病毒(CSFV)的全基因组序列,应用Primer 6.0软件设计针对5'-UTR区域的1型、2型BVDV特异性通用引物对,扩增目的片段,并对该方法进行特异性、敏感性、重复性试验及利用该方法开展临床样品检测。结果显示:扩增的目的片段长度约为302 bp;该方法的灵敏度为2.09×102 copies/μL,无非特异性扩增,且重复性良好。对采自山东省发病牛场的13份鼻腔棉拭子和9份牛血清临床样品进行检测,发现有8份鼻腔棉拭子和8份血清为BVDV阳性,随机抽取4份阳性样品送测序,发现3份样品毒株为1型BVDV,1份样品还需进一步鉴定。本研究建立的RT-PCR方法可实现对1型、2型BVDV核酸的特异性检测,也可用于该病的流行病学调查研究。 相似文献
7.
牛冠状病毒和轮状病毒的双重RT-PCR检测方法的建立及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立一种快速诊断牛病毒性腹泻疾病的方法,利用本研究室分离鉴定的牛冠状病毒(BCV)和牛轮状病毒(BRV)毒株,根据GenBank中登录的BCV、BRV核苷酸序列分别设计并合成了两对能特异性扩增BCV、BRV的引物,经过条件优化,建立了检测BCV、BRV的双重PCR方法,扩增两种病毒的片段分别为244 bp和382 bp.该方法检测BCV和BRV的敏感度分别为1个和100个TCID50/100μL.应用这一方法能从病料中检测出这2种病毒.结果表明该双重RT-PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于这2种病毒性疾病的快速诊断. 相似文献
8.
9.
牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的建立 总被引：3，自引：0，他引：3
根据牛传染性鼻气管炎病毒gB基因序列,合成GH-1、GH-2两条引物,分别以IBRV的Barta Nu/67株、IBRVBK125株基因组DNA为模板进行扩增,结果两株IBR病毒DNA均可扩增出362bp的特异性片段;对其同属的伪狂犬病毒（PRV）、火鸡疱疹病毒（HVT）及牛病毒性腹泻-粘膜病病毒（BVDV）进行扩增均未见特异性条带;敏感性检测表明,该法对IBR病毒的检出限量为104.25TCID50/0.1mL. 相似文献
10.
《中国畜牧兽医》2015,(9)
为分离鉴定新疆地区牛病毒性腹泻—黏膜病病毒(BVDV)流行毒株,掌握该毒株的生物学特性,本试验在新疆北疆部分地区采集牛病毒性腹泻—黏膜病(BVD/MD)疑似病例的粪便,通过RT-PCR检测、细胞分离培养、间接免疫荧光抗体检测、免疫电镜观察及血清中和试验5种方法对毒株进行分离和鉴定。对毒株的TCID50测定后,再对毒株分别进行乙醚敏感性试验、氯仿敏感性试验、胰蛋白酶敏感性试验、酸碱度敏感性试验、温度敏感性试验及核酸分型试验等理化特性检测。经RT-PCR诊断,病料在286bp处出现了目的片段。将RT-PCR诊断为阳性的粪便,接种于密度约为80%的单层MDBK细胞出现了细胞病变,盲传5代至出现典型的细胞病变。将F5代细胞培养物采用间接免疫荧光抗体检测,结果产生了与C24V标准毒株相同的特异性黄绿色荧光。免疫电镜观察到了大量呈球形的BVDV粒子,大小20~40nm。血清中和试验中抗体阳性血清处理组细胞均未出现细胞病变,病毒完全被抗体阳性血清中和。综合以上方法确定分离株为BVDV毒株。对分离株进行毒价和理化特性测定,该毒株TCID50为10-4.5/0.1mL,对乙醚和氯仿敏感,对胰蛋白酶敏感,耐碱不耐酸,对温度敏感,经54℃1h完全被灭活,属于RNA病毒。本试验成功分离到一株新疆BVDV流行毒株,掌握了该毒株的生物学特性,为今后该病的诊断和防控奠定了基础。 相似文献
11.
根椐GenBank中已发表的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCV)和牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRV)3种病毒基因序列,设计引物。在建立各病毒单项RT-PCR技术的基础上,优化三重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的三重RT-PCR技术,用这3对引物对同一样品中的BVDV、BCV、BRV核酸模板进行三重RT-PCR扩增,结果可同时扩增BVDV的466 bp,BCV的685 bp,BRV的247 bp的特异性片段,而对猪瘟病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒和牛副流感病毒3型扩增结果均为阴性。敏感性测定表明,该三重RT-PCR技术能检出10 pg的BVDV、1 pg的BRV和10 pg的BCV模板。用45份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,显示两者的总符合率为100%。表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。 相似文献
12.
牛病毒性腹泻病毒一步法RT-PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据牛病毒性腹泻/粘膜病病毒5'端非结构蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,建立检测牛病毒性腹泻/粘膜病病毒244 bp片段的RT-PCR一步法。该方法对牛病毒性腹泻/粘膜病病毒NADL、OregonC24V和长春184毒株各标准毒株检测,结果均为阳性。对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达0.1 TCID50;而对牛传染性鼻气管炎病毒、猪瘟病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的细胞培养物进行检测,结果均为阴性。检测460份不同样品,与病毒分离试验比较,符合率100%,证明该方法特异性强,敏感性高。初步结果表明所建立的一步法RT-PCR技术可用于牛病毒性腹泻/粘膜病的检测及流行病学调查。 相似文献
13.
从云南某牛场疑似BVDV感染的病料通过接种MDBK细胞分离到1株BVDV,将其命名为BVDV/W。该分离毒株连传15代均不产生CPE,为NCP型BVDV。通过电镜检测可观察到直径为 40～60nm病毒粒子。该分离病毒能被牛病毒性腹泻标准阳性血清中和,且能被BVDV IFA荧光抗体识别;针对常用作BVDV基因分型的5′-UTR设计特异性引物,经RT-PCR可扩增出288bp特异性片段。将所测的目的片段序列与中参考序列进行同源性比较,结果显示与293株和Y2株同源关系较近,分别为90.0%和89.9%,与2014年以来我国报道的分离株同源性在88%左右,具有一定的代表性。5′-UTR遗传进化分析证实该分离毒株为BVDV-1型。动物回归试验显示,该分离毒株可引起出现体温升高、腹泻、粘膜病等典型的BVD/MD症状,表明该毒株为1株BVD强毒株。 相似文献
14.
根椐GenBank中牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)和牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV-3)3种病毒基因序列,设计合成引物,建立3种病毒的三重RT-PCR方法。用这3对引物对同一样品中的BVDV、BRSV和BPIV-3核酸模板进行三重RT-PCR扩增,结果显示:可同时扩增BVDV的466 bp,BRSV的735 bp和BPIV-3的258 bp的特异性片段,而对其他4种病原的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该三重RT-PCR技术能检出10 pg的BVDV、1 pg的BPIV-3和10 pg的BRSV模板。用37份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示:两者的总符合率为100%。结果表明:建立的多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。 相似文献
15.
牛轮状病毒与病毒性腹泻病毒的双重RT-PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
建立了能够同时检测牛轮状病毒(BRV)与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的双重RT-PCR方法.应用两对特异性引物进行了双重RT-PCR扩增,这两对引物分别对应于BRV的VP7基因和BVDV的5-UTR中的部分编码序列,其扩增产物分别为342bp和196bp.说明该方法的特异性强、敏感性高,可检测到1pg的病毒RNA,可应用于临床诊断和流行病学研究. 相似文献
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【目的】查明并掌握辽宁地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)的流行特性及生物学特点,为BVDV的防治提供理论基础和技术支持。【方法】采集辽宁省某养牛场疑似发生BVDV感染的病死牛脾脏组织,用牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus, BRSV)、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)及BVDV基因特异性引物进行RT-PCR鉴定,将组织液接种MDBK细胞分离病毒。对细胞进行细胞病变效应(CPE)观察后再通过电镜观察、间接免疫荧光试验(IFA)鉴定病毒,PCR扩增病毒全基因组序列并对其进行遗传进化分析。【结果】BVDV特异性引物RT-PCR鉴定结果为阳性,在280 bp处有条带,与预期条带大小相符,其余病原特异性引物未扩增出条带,证明未感染其他病原;分离得到的毒株在MDBK细胞中培养未出现明显细胞病变效应;病毒纯化后,... 相似文献
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鉴别牛病毒性腹泻病毒和猪瘟病毒的复合PCR方法及其应用 总被引：6，自引：0，他引：6
以牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)特异引物 P1/ P3扩增 BVDV标准毒株及以猪瘟病毒 (HCV)特异引物 P2 / P3扩增HCV阳性病料 ,分别扩增出 32 6 bp和 2 5 2 bp的特异片段 ;以 P1、P2、P3扩增 BVDV和 HCV人工混合感染样品 ,扩增出大小为 32 6 bp和 2 5 2 bp的 2条片段 ,建立了特异的一步检测 BVDV和 HCV的复合 PCR方法。以建立的复合 PCR方法检测 BVDV分离株 ,都扩增出 1条 32 6 bp的特异片段 ;从吉林等地送检的病料和猪瘟兔化弱毒疫苗中扩增出一2 5 2 bp的特异片段 ,从长岭地区的疑似猪瘟病猪的血清病料中 ,同时扩增出 32 6 bp和 2 5 2 bp的核酸片段 ,表明长岭某猪场流行的“猪瘟”为 BVDV和 HCV混合感染。本研究为进行 HCV和 BVDV的鉴别诊断与流行病学调查提供了有效的方法。 相似文献
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牛病毒性腹泻病毒一步法RT-PCR检测方法的建立与应用 总被引：2，自引：1，他引：1
为建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒病原的方法,本研究根据GenBank上登录的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)基因组序列,设计1对引物,建立了检测BVDV的一步法RT-PCR方法。该方法对牛传染性鼻气管炎病毒、猪瘟病毒、牛副流感病毒3型的扩增结果均为阴性,检测的敏感性达1 ng RNA。该一步法RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可以准确快速检测出极低含量的BVDV,将为BVDV的病原检测及分子流行病学调查等提供一种快速、灵敏、特异、准确的分子生物学检测方法。 相似文献
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根据GenBank上已发表的猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的全基因序列,进行对比分析,分别设计合成两对能特异性扩增CSFV、BVDV的引物。经过条件优化后,建立了检测CSFV和BVDV的双重RT-PCR方法,扩增两种病毒的片段,大小分别为938、650 bp。应用该方法对11批牛睾丸细胞、7批胎牛血清、60个批次的猪瘟细胞苗、10份全血样及10份组织样进行检测。通过试验证明,所建立的方法具有良好的特异性和敏感性,为防止猪瘟细胞苗的污染及进行CSFV和BVDV鉴别诊断提供了有效方法。 相似文献