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1.
为了获得β-甘露聚糖酶基因manA的转基因小鼠,从黑曲霉中克隆得到β-甘露聚糖酶基因manA,进行体外表达检测甘露聚糖酶活性后,将此基因插入到含有猪腮腺分泌蛋白(PSP)基因启动子的表达载体pPSPBGPneo中,得到在腮腺组织特异表达β-甘露聚糖酶基因manA的载体pPSP-manA,总长为16.3 kb,将其进行线性化后回收得到高质量DNA片段,通过显微注射得到17只原代小鼠,进行PCR和Southern blot检测发现有6只阳性转基因小鼠,表明转β-甘露聚糖酶基因manA小鼠制备成功. 相似文献
2.
以小鼠脾脏cDNA为模板，用降落PCR扩增IL-1Ra基因片段，IL-1Ra基因片段长约为537 bp。将IL-1Ra扩增片段和原核表达载体pET-30a(+)连接构建重组表达质粒，在37℃诱导表达，重组表达的小鼠IL-1Ra蛋白的分子质量为19 ku。用纯度较好的小鼠IL-1Ra重组蛋白免疫兔子，制备特异性多克隆抗体；测定多克隆抗体的效价达到1∶4 096 000。经Western-Blot鉴定该抗体可与Raw264.7细胞中表达的小鼠IL-1Ra天然蛋白发生特异性结合。利用实时荧光定量PCR和Western-Blot检测表明布鲁氏菌S2弱毒株感染Raw264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞)后小鼠IL-1Ra上调表达。本研究成功制备了小鼠IL-1Ra重组蛋白和兔抗多克隆抗体，为深入探讨小鼠IL-1Ra与布鲁氏菌感染之间的关系提供工具。 相似文献
3.
根据已发表的马立克氏病病毒(MDV)血清I型与鸡白介素2(IL-2)DNA序列,设计两对引物,用PCR扩增出MDV gB基因和IL-2基因,并克隆入pEGFP-C1载体,构建了载体pC1-gB-IL.通过酶切分离外源基因表达盒,并将外源基因表达盒插入pTK2B质粒,成功构建了转移载体pT-C-gB-IL.将转移载体pT-C-gB-IL转染CEF细胞,培养36～48 h后,经荧光显微镜观察,有荧光出现,证明该载体得到表达,并通过Western-blotting鉴定证明MDV gB和IL-2的融合基因得到了有效的表达. 相似文献
4.
中国荷斯坦奶牛IL-18基因的克隆与真核表达研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为了克隆并表达中国荷斯坦奶牛白介素18(interleukin,IL-18)基因,用牛白介素18基因特异性引物对刀豆蛋白(ConA)刺激后荷斯坦奶牛外周血单核细胞(PBMCb)总RNA进行RT-PCR扩增,并将扩增产物纯化后克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定,将目的基因亚克隆到真核表达载体pGFP-C1中,构建了重组质粒pGFP-IL-18,转染BHK-21细胞,检测目的基因是否表达.结果:该基因全长582 bp,编码193个氨基酸,与羊、犬和猪IL-18基因相比,核苷酸序列有较高的同源性,但与小鼠和鸡IL-18基因相比有明显的种属差异,转染48 h后,可在转染细胞胞浆中检测到黄绿色的荧光,表明已成功克隆了中国荷斯坦奶牛IL-18基因,并实现了该基因在真核细胞中的表达. 相似文献
5.
目的 克隆含人gp130和IL-12Rβ2胞外段的基因并构建人gp 130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因真核表达载体.方法 设计合成特异性引物,以人外周血单个核细胞(PBMC)cDNA为模板,PCR法扩增gp130胞外段基因和IL-12Rβ2胞外段基因;应用T-A克隆技术和亚克隆技术,构建骨架为GV140的人gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因真核表达载体.结果 PCR扩增得到人gp130胞外段基因,IL-12Rβ2胞外段基因和gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因片段,克隆得到重组体GV 140-gp 130-IL-12Rβ2,测序验证了重组体的准确性.结论 成功构建了人gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因真核表达载体. 相似文献
6.
鸡IL-2基因克隆及其重组质粒的构建与表达 总被引：2，自引：0，他引：2
利用一对自行设计的引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),从ConA诱导的5周龄SPF鸡脾细胞中扩增出鸡白细胞介素2(IL-2)基因片段,其长度为439 bp,经酶切鉴定,初步确定为鸡IL-2基因.再将该IL-2基因片段定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经DNA序列鉴定,表明构建的重组质粒含有IL-2基因,该基因的cDNA序列与Sundick报道的结果基本一致.然后,将IL-2基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,并导入菌株BL21, 经诱导培养、蛋白提取和SDS-PAGE,获得分子量约为42 000的蛋白条带,表明所克隆的鸡IL-2基因在原核细胞中得到表达. 相似文献
7.
以鞭毛蛋白(flagellin)作为载体蛋白,通过化学偶联至金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5),并在小鼠模型上检验多糖疫苗对小鼠存活及其乳腺的保护作用.将小鼠分为4组:生理盐水组、CP5单独免疫组、牛血清白蛋白(BSA)-CP5偶联组和flagellinCP5偶联组,每组10只,分别进行皮下免疫,均含CP5 10 μg;共免疫两次,两次免疫间隔3周.第2次免疫两周后,用金黄色葡萄球菌分别对小鼠腹腔、乳腺进行攻毒,并通过实时定量PCR对乳腺组织细胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ、IL-12的表达进行检测.结果表明,CP5偶联鞭毛蛋白疫苗对小鼠乳腺具有显著的保护效果,并在乳腺组织部位诱导了Th1型细胞因子表达,说明鞭毛蛋白是CP5的理想载体蛋白. 相似文献
8.
为弄清犬白介素-15(cIL-15)能否增强犬细小病毒VP2DNA疫苗的免疫原性,本研究首先通过RT-PCR方法从犬脾脏淋巴细胞中扩增全长cIL-15cDNA基因,并构建其与Myc-His-tag融合和非融合的表达载体:pcDNA-cIL-15/MH和pcDNA-cIL-15。将pcDNA-cIL-15/MH载体转染HEK293T细胞,确定构建的表达载体能否介导cIL-15进行分泌表达。利用过去构建的VP2表达载体和pcDNA-cIL-15载体共免疫小鼠,用ELISA检测免疫后小鼠血清中的抗体滴度,并用MTT检测小鼠淋巴细胞的增殖活性和用ELISA测定淋巴细胞干扰素-γ和IL-4的表达。结果显示,构建的cIL-15表达载体能够介导cIL-15在真核细胞中的分泌表达。用VP2和cIL-15表达载体共免疫小鼠,抗体水平明显高于VP2载体单免疫组(P0.01)。当免疫35d时,共免疫组淋巴细胞的刺激指数、干扰素-γ和IL-4的表达水平均明显高于VP2载体单免疫组(P0.05)。结果表明,cIL-15可明显增强VP2DNA疫苗的免疫原性。 相似文献
9.
为构建小鼠锰超氧化物歧化酶(SOD)的原核表达载体,在大肠杆菌中进行蛋白表达、纯化和功能检测,以小鼠肝脏cDNA为模板,利用PCR方法克隆小鼠锰SOD基因,PCR扩增了1个长600bp左右的基因片段,该片段编码由198个氨基酸组成的成熟的小鼠锰SOD蛋白.将其插入pET15b载体中,经测序鉴定正确后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta-gami.含有pET15b-mMn-SOD质粒的工程菌经过IPTG诱导能表达出相对分子质量约25000的目的蛋白,超声破碎菌体,经Ni-NTA纯化后得到纯度约为95%的重组mMn-SOD蛋白.SOD活性检测表明经过诱导表达的mMn-SOD比活力为531.7U/mg. 相似文献
10.
【目的】分别构建牛fabp3和fabp4基因真核表达载体,并观察载体转染小鼠成肌细胞后基因的表达以及对内源fabp3和fabp4基因表达的影响,检测肉质性状形成相关基因在转基因细胞中的表达及对内源功能基因的影响。【方法】 以pDsRED质粒为骨架载体,分别将人肌红蛋白启动子与目的基因相连、CMV启动子与红色荧光蛋白报告基因相连构建肌肉特异性表达fabp3基因的载体pDsHF3和表达fabp4基因的载体pDsHF4;用脂质体瞬时转染小鼠成肌细胞,72 h后用2%孕马血清诱导成肌细胞向肌管的分化;利用real-time PCR技术检测转染前后成肌细胞中外源牛fabp3和fabp4基因和内源小鼠fabp3和fabp4基因的表达量。【结果】与对照组相比,小鼠成肌细胞分别转染pDsHF3和pDsHF4表达载体,24 h后外源牛fabp3和fabp4基因均获得高水平的表达,48 h后有所回落;而内源小鼠fabp3和fabp4基因在成肌细胞和诱导分化的肌管细胞中的表达均受到不同程度的影响。【结论】构建的真核表达载体能在成肌细胞中高效表达,外源牛fabp3或fabp4基因的转入能够影响小鼠成肌细胞及肌管中内源fabp3和fabp4基因的表达。 相似文献
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采用PCR方法从微小隐孢子虫基因组中扩增cp735基因.与pMD- 18T载体连接后,挑取阳性重组子测序分析.用基因重组技术将Cp735基因克隆入原核表达载体pET-28a中,构建Cp735基因的重组原核表达载体pET28a-Cp735.将pET28a-Cp735在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,并用SDS- ... 相似文献
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SUMO融合系统高效表达可溶性鼠源FGF-21及其活性的研究 总被引：1，自引：1，他引：0
利用SUMO表达载体在大肠杆菌中高效可溶性表达鼠源成纤维细胞生长因子(FGF-21)成熟蛋白,并研究其调节血糖的功能。将鼠源FGF-21成熟蛋白基因亚克隆至SUMO表达载体上,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,并用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组蛋白,透析后利用SUMO蛋白酶I切割融合蛋白,获得纯度较高的成熟蛋白。将3T3-L1成纤维细胞分化成脂肪细胞,经微量化的GOD-POD法检测培养基中葡萄糖含量,统计学分析葡萄糖消耗率。结果表明,在SUMO表达体系中鼠源FGF-21成熟蛋白基因以可溶形式表达,且可被SUMO蛋白酶I有效地切割,获得纯度较高的成熟蛋白。与未经处理的脂肪细胞对照组相比,经鼠源FGF-21成熟蛋白处理后脂肪细胞对葡萄糖的摄取利用显著增加,残存在培养基中的葡萄糖含量明显减少;两样本比较的t检验,P<0.001,差异极显著。 相似文献
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The mammary gland provides a novel method for producing recombinant proteins in milk of transgenic animals. A key component in the technology is the construction of an efficient milk expression vector. Here, we established a simple method to construct a milk expression vector, by a combination of homologous recombination and digestion-ligation. Our methodology is expected to have the advantages of both plasmid and bacterial artificial chromosome (BAC) vectors. The BAC of mouse whey acidic protein gene (mWAP) was modified twice by homologous recombination to produce a universal expression vector, and the human lysozyme gene (hLZ) was then inserted into the vector by a digestion-ligation method. The final vector containing the 8.5 kb mWAP 5′ promoter, 4.8 kb hLZ genomic DNA, and 8.0 kb mWAP 3′ genomic DNA was microinjected into pronuclei of fertilized mouse embryos, to successfully generate two transgenic mouse lines that expressed recombinant human lysozyme (rhLZ) in milk. The highest expression level of rhLZ was 0.45 g·L−1, and rhLZ exhibited the same antibacterial activity as native hLZ. Our results have provided a simple approach to construct a universal milk expression vector, and demonstrated that the resulting vector regulates the expression of hLZ in milk. 相似文献
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粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是机体免疫系统的重要细胞因子,具有生物佐剂作用,为研究GM-CSF的生物佐剂作用,本试验通过RT-PCR方法从小鼠脾脏细胞中扩增小鼠GM-CSF的cDNA,并将其插入到pcDNA3.1质粒中,构建成GM-CSF真核表达载体pcDNA3.1-GMCSF,并在真核细胞进行了瞬时表达。结果表明,本研究扩增的小鼠GM-CSF基因序列与GenBank序列完全一致,表达载体经脂质体介导转染HEK293T细胞,表达产物经western-blot检测,证明GM-CSF能够在HEK293T细胞中进行分泌表达。这为今后研究GM-CSF在动物疫苗,特别是DNA疫苗中的生物佐剂作用创造了必要的条件。 相似文献
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利用乳酸乳球菌nisin诱导基因表达系统(the Nisin Controlled gene Expression system,NICE)表达TK酶基因.采用基因克隆和表达方法,表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定.重组质粒测序结果表明,转化到乳酸乳球菌中的TK基因与pWSTK6基因(登录号为EU530625.1)相... 相似文献
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为探讨超急排斥反应(hyperacute rejection,HAR)及延迟性异种排斥反应(delayed xenograft rejec-tion,DXR)分子调控机制,进行-α1,2岩藻糖苷转移酶基因(hHT)与绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)融合表达载体pEGFP-C1-hHT的构建及在小鼠成纤维细胞表达的研究。采用脂质体法转染小鼠成纤维细胞48 h后观察到GFP阳性细胞。同时对GFP阳性小鼠成纤维细胞进行PCR及Western blot,检测hHT基因的整合及表达情况。PCR结果表明hHT基因整合入小鼠基因组,Western blot检测到hHT基因的表达。研究结果表明,成功克隆hHT基因并构建了融合表达载体pEGFP-C1-hHT,可应用于进一步转基因研究。 相似文献
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利用SUMO融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
利用pSUMO表达载体在大肠杆菌中高效可溶性表达若干种外源蛋白,如鼠源成纤维细胞生长因子(FGF)-21、人源FGF-21、人源白细胞介素(IL)-1β,并与pET-30a(+)及pTYB11表达系统作比较。将鼠源FGF-21、人源FGF-21及人源IL-1β基因分别亚克隆至pSUMO表达载体上,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,并用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组蛋白,透析后利用SUMO蛋白酶I切割融合蛋白,获得纯度较高的成熟蛋白。上述基因在pET-30a(+)及pTYB11中表达量极低,考马斯亮蓝染色几乎检测不到。在pSUMO表达体系中这些基因均以可溶形式表达,且可被SUMO蛋白酶I有效的切割,获得纯度较高的成熟蛋白。上述蛋白可在pSUMO表达系统中获得高效可溶性表达。 相似文献
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目的:建立可表达血清淀粉样P成分(SAP)转基因小鼠模型,以研究SAP基因的功能。方法:采用基因重组技术将SAP基因插入到pCMV-Tag5A真核表达载体上。经BciVI限制性内切酶酶切后,琼脂糖凝胶电泳回收2.7 kb目的片断,受精卵原核显微注射法将其注入雄原核,制备转基因小鼠。采用PCR法在基因水平筛选SAP转基因小鼠阳性小鼠;免疫沉淀法结合免疫印迹法在蛋白水平检测SAP基因在PCR阳性转基因小鼠中的表达情况。结果:成功构建了pCMV-Tag5A/mSAP真核表达载体。经显微注射法将2.7 kb线性目的基因片断注射入受精卵雄原核,移植入代孕母鼠,所生127只小鼠,其中PCR鉴定获得10只转基因阳性小鼠。免疫沉淀法和免疫印记法随机检测83#♂founder、7#♀founder与C57 BL/6J小鼠回交F1代PCR阳性转基因小鼠血清中外源SAP基因蛋白水平的表达,发现均有表达。结论:该研究以C57BL/6J小鼠为研究对象,成功地产生能稳定遗传SAP基因的过表达转基因小鼠模型,它将有利于研究SAP基因在炎症、淀粉样沉淀、自身免疫系统中的作用。 相似文献
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小鼠精子经2%DMSO处理与酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经细胞内特异表达钙结合蛋白D-28k(CaBP)的构件pTH-CB孵育,PCR筛选体外受精移植出生的仔鼠后代,通过测定黑质致密部、腹侧被盖区、大脑皮层和海马CaBP表达量以及黑质致密部CaBP阳性细胞数验证转基因鼠calbindin D-28k表达.结果表明:获得2只在脑内TH阳性神经细胞内特异性表达calbindin D-28k且稳定遗传目的基因原代鼠,表达CaBP具有抗MPTP诱导的神经细胞损伤功能.结果说明脑组织特异性表达calbindin D-28k转基因鼠谱系建立. 相似文献
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【目的】明确水牛Tle6基因表达组织特异性及其在卵母细胞和早期胚胎中的表达模式,并通过构建原核表达载体诱导表达融合蛋白及免疫小鼠制备TLE6多克隆抗体,为进一步揭示Tle6基因在水牛生殖发育中的作用机制提供理论依据。【方法】采用RT-PCR扩增水牛Tle6基因编码区（CDS）序列,经生物信息学分析后,分别以半定量PCR和实时荧光定量PCR检测分析水牛Tle6基因表达组织特异性及其在卵母细胞和早期胚胎中的表达模式。构建重组原核表达载体,以IPTG诱导表达的融合蛋白免疫小鼠制备TLE6多克隆抗体,再利用TLE6多克隆抗体检验TLE6蛋白在水牛不同组织及卵母细胞和早期胚胎中的表达情况。【结果】水牛Tle6基因CDS序列全长1731 bp,编码576个氨基酸残基,其编码蛋白分子量为64.09 kD,理论等电点（pI）为5.69,属于亲水性蛋白。Tle6基因仅在水牛的卵母细胞中特异性表达。重组原核表达载体p ET-32a-Tle6转化BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导6 h,融合蛋白TLE6的表达量最高,且以可溶性蛋白和包涵体2种形式进行表达;以纯化的融合蛋白TLE6免疫小鼠成功制备获得TLE6多克隆抗体,其抗体效价为1∶64000,能与融合蛋白TLE6及水牛卵母细胞发生特异性反应,即具有很强的特异性。【结论】Tle6基因仅在水牛卵母细胞中特异性表达,而在其他组织中未见表达。不同于其他MEGs的表达模式,Tle6基因在水牛卵母细胞及胚胎早期发育过程中呈特异性持续表达,可能在水牛卵母细胞成熟及附植前的胚胎发育过程中发挥重要作用。 相似文献