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1.
为了筛选出环形泰勒虫TRAP蛋白在虫体入侵媒介蜱唾液腺过程中相互作用蜱源蛋白,构建了能够用于酵母双杂交筛选系统的重组诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A。本研究以环形泰勒虫裂殖体为材料,根据环形泰勒虫TRAP-A结构域的基因序列设计引物,经过PCR扩增获得576 bp的基因片段,将其连接到线性化载体pGBKT7上。经双酶切鉴定和序列分析以及重组诱饵质粒在酵母双杂交系统中的自激活、细胞毒性及其表达情况检测,结果显示,本研究成功构建了酵母双杂交重组诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A,构建的诱饵质粒对Y2HGold酵母菌无自激活活性和细胞毒性,且构建的诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A可以在Y2HGold酵母菌内正确表达。表明所构建的诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A可以用于筛选小亚璃眼蜱唾液腺酵母双杂交c DNA文库,获得可能与环形泰勒虫TRAP-A蛋白相互作用的蜱源蛋白。 相似文献
2.
《中国动物传染病学报》2016,(1)
为了筛选出柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶(Et CDPK4)在虫体内发挥作用时的作用受体即相互作用蛋白,构建了能够应用于筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交c DNA文库的诱饵重组质粒p GBKT7-Et CDPK4,本研究以柔嫩艾美耳球虫子孢子为材料,提取了总RNA,经反转录得到c DNA第一链,利用PCR的方法扩增获得了该基因大小为1660 bp的Et CDPK4的功能区片段,并将其连接于酵母BD诱饵p GBKT7载体上,经双酶切鉴定和序列分析,以及检测了p GBKT7-Et CDPK4在酵母双杂交系统中的自激活、细胞毒性和表达情况。结果显示,成功构建了酵母双杂交诱饵重组质粒p GBKT7-Et CDPK4,在酵母双杂交系统中没有自激活活性和细胞毒性,且在酵母细胞Y2HGold中能够进行表达。表明所构建的诱饵质粒p GBKT7-Et CDPK4可以应用于酵母双杂交系统中,用于筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交c DNA文库,获得可能与Et CDPK4具有相互作用的蛋白质。 相似文献
3.
为构建DEV UL24/C蛋白的酵母双杂交的诱饵载体,本研究以DEV CHv株基因组DNA为模板,经一步法克隆构建pGBKT7-UL24/C诱饵质粒,质粒转化酵母菌株后进行自激活活性检测、免疫印迹检测和毒性检测。结果显示,诱饵质粒pGBKT7-UL24/C插入片段大小为510 bp,且未发生基因突变;pGBKT7-UL24/C质粒转化Y2HGold菌株后的自激活检测显示诱饵菌株无自激活活性,免疫印迹检测表明该诱饵菌株成功表达DEV UL24/C蛋白,毒性检测表明该诱饵蛋白对宿主菌Y2HGold无毒性作用。综上表明,未研究正确构建了UL24/C基因酵母双杂交诱饵载体Y2HGold(pGBKT7-UL24/C),为筛选与DEV UL24蛋白相互作用蛋白、探究DEV UL24蛋白功能及分子机制奠定了基础。 相似文献
4.
为筛选与血吸虫抱雌沟蛋白相互作用的因子,本研究以抱雌沟蛋白（gynecophoral canal protein ofSchistosoma japonicum,SjGCP）为诱饵蛋白构建了用于酵母双杂交筛选系统的重组质粒。根据日本血吸虫抱雌沟蛋白的基因序列设计引物,经过PCR扩增、酶切回收,与经相应酶切的线性化载体pBGKT7-BD连接构建重组质粒。随后将重组质粒pGBKT7-BD-SjGCP转化酵母菌株,测定融合蛋白BD-SjGCP在酵母菌中的自激活活性、对酵母菌生长的影响及在酵母中的表达情况。结果显示构建的重组诱饵蛋白质粒pGBKT7-BD-SjGCP能够在酵母细胞内正确表达,没有独自激活报告基因表达的活性,且其表达对酵母细胞没有毒性,不影响酵母细胞的生长。可见,重组质粒pGBKT7-BD-SjGCP可用于筛选与血吸虫抱雌沟蛋白相互作用的物质。 相似文献
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6.
为筛选与鹅细小病毒VP2和VP3蛋白相互作用的鹅胚成纤维细胞蛋白,构建VP2和VP3蛋白的诱饵载体pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3。从pGEX-4T-VP1质粒中PCR扩增VP2和VP3基因,克隆至pMD-18T载体中,经测序验证鉴定后定向克隆到酵母双杂交载体pGBKT7中。将2个重组诱饵载体经PCR、酶切和测序验证后分别转化酵母菌H2YGold中,检测其在酵母细胞中有无自激活和毒性作用。结果表明:成功构建了pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3诱饵载体,且其对报告基因无自激活作用,对酵母细胞无毒性。由此说明,诱饵载体pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3可用于酵母双杂交系统筛选与VP2和VP3蛋白相互作用的细胞结合蛋白。 相似文献
7.
通过PCR获得流产型布鲁氏菌Omp22基因的编码区,将其克隆到pSOS载体中,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pSOS-Omp22。测序正确后,将重组质粒导入cdc25H检测其表达产物对酵母细胞有无毒性和自激活作用,且在酵母细胞中定位是否正确。结果表明,获得了正确的流产型布鲁氏菌Omp22基因编码区,并成功克隆到pSOS诱饵载体中,且转化有诱饵载体的cdc25H在SD/Glucose(-L)营养缺陷平板上生长良好,说明表达产物对酵母细胞无毒性,对报告基因也无自激活作用且其定位正确。表明pSOS-Omp22可应用在酵母双杂交系统中,用于寻找巨噬细胞cDNA文库中与Omp22相互作用的蛋白质。 相似文献
8.
应用酵母双杂交系统初步筛选IBDV VP2结合蛋白 总被引：1，自引：0，他引：1
用RT-PCR扩增VP2 cDNA并克隆入诱饵载体pSos,与鸡法氏囊cDNA文库中分离的质粒DNA共转化cdc25H,筛选阳性酵母克隆;用酵母质粒DNA转化大肠杆菌,提取质粒再分别与诱饵载体pSosVP2共转化酵母细胞,利用酵母双杂交系统对阳性克隆进行验证.对阳性克隆的插入片段进行序列分析,根据生物信息学分析结果初步确定IBDV VP2结合蛋白编码基因.结果显示,经酵母双杂交共筛选出48个候选阳性克隆,分别转化酵母菌,经酵母双杂交验证后,获得阳性克隆19个.进一步的序列分析显示,在19个插入序列中,共编码8种不同的多肽,分别是Ras超家族中的RRAS2、Rit1和N-Ras,肿瘤相关蛋白TCTP和PARP14,抗病毒Mx蛋白,LAMB3蛋白以及蛋白激酶PRKX.VP2候选结合蛋白的获得为IBDV受体、诱导细胞凋亡或逃逸宿主抗病毒机制等研究奠定了基础. 相似文献
9.
利用PCR技术扩增获得PPRV-tH基因片段,将其克隆至酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7中,经酶切、测序验证其正确插入后,将重组诱饵质粒转化酵母菌AH109中,检测其在酵母中有无渗漏、自我激活作用和毒性。利用Western blotting分析诱饵蛋白在酵母中的表达情况,以鉴定其作为诱饵蛋白的可行性。结果表明,成功扩增到了PPRV-tH,并正确构建了pGBKT7-tH诱饵表达载体,此载体在酵母细胞AH109中无毒性、渗漏和自我激活能力,且能正确表达tH蛋白。 相似文献
10.
为筛选与弓形虫棒状体蛋白38基因(Rop38)相互作用的宿主细胞蛋白,本研究利用MatchmakerTM Gold酵母双杂交系统,构建了人成纤维细胞(HFF)和人T细胞(CEM.NKR)的c DNA文库,以构建的p GBKT7-Rop38作为诱饵质粒,采用PEG/Li Ac法转化酵母菌株Y2H,利用表型筛选法检测Rop38的自激活作用并进行酵母双杂交筛选。结果表明,诱饵蛋白在酵母双杂交系统中无毒性和自激活作用,而且通过酵母双杂交筛选共获得29个与Rop38蛋白相互作用的宿主蛋白,其中HFF文库筛选到20个蛋白,CEM.NKR文库筛选到11个蛋白。本实验为进一步研究Rop38调节宿主细胞基因表达的信号通路奠定了基础。 相似文献
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The immediate-early (IE) protein BICP0 of bovine herpesvirus-1 (BHV-1) may have other functions besides transactivation of viral promoters. Recently, we observed that BICP0, delivered to cultured cells by a helpervirus-free amplicon system, forms spherical or doughnut-like structures in which the tumor suppressor protein p53 is sequestered. The objective was to determine whether BICP0 and p53 interact physically, we used both yeast and mammalian two-hybrid systems. As a bait plasmid, pVA3 which encodes a hybrid protein consisting of the Gal4 DNA binding domain fused to murine p53 was used. The BICP0 gene or its truncated versions were inserted into the prey plasmid pGAD424. Bait and prey plasmids were cotransformed into yeast strain Y153, which has LacZ and HIS3 reporter genes under the control of Gal4 upstream activating sequence. After 4-6 days, colonies were stained for beta-galactosidase activity. In the mammalian two-hybrid system, pM-53 was used as a bait where truncated p53 fused to Gal4 DNA binding domain is expressed. The BICP0 gene was cloned into prey plasmid pVP16. The interaction between p53 and SV40 T-antigen was evaluated as a positive control in both systems. Neither full-length BICP0 nor its truncated derivatives induced beta-galactosidase activity in yeast whereas the positive control turned blue under the same conditions. The mammalian two-hybrid system, in which chloramphenicol acetyltransferase (CAT) activity was used as a reporter, also failed to show an interaction between these two proteins. Co-localization of p53 with BICP0 in spherical structures is unlikely to result from a direct physical interaction between these two proteins. Mediation by additional cellular proteins may be required. 相似文献
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利用Sos招募系统（SRS）,通过聚合酶链反应（PCR）扩增羊布鲁菌16MVjbR基因的编码序列,定向克隆到酵母表达载体pSos中,构建诱饵重组质粒pSos－VjbR,经测序正确后其将转入酵母菌cdc25H（α）感受态细胞,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无自激活作用。结果表明,经序列测定证实重组诱饵质粒pSos－VjbR构建成功。重组质粒转化入酵母细胞后,经检测其表达产物对cdc25H（α）酵母细胞无毒性作用,对报告基因亦无自激活作用。这为利用SRS来研究与羊布鲁菌16MVjbR蛋白相互作用的蛋白奠定了基础。 相似文献
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PA蛋白是禽流感病毒(AⅣ)聚合酶的组成部分,对AIV的复制具有重要作用.为鉴定家鸭体内与AIV PA蛋白相互作用的宿主蛋白,本研究利用酵母双杂交系统,以表达A/goose/Hubei/65/05(H5N1)AIV PA蛋白的重组质粒为诱饵,筛选家鸭脑组织cDNA文库,鉴定得到一个cDNA片段,经测序分析表明,该cDNA片段编码蛋白为色素域解旋酶DNA结合蛋白9(CHD9).将重组诱饵质粒pDEST32-PA与捕获的鸭cDNA重组质粒共转化MaV203受体菌,进行X-gal显色反应检测,分析结果显示,菌落可以迅速变蓝,并且菌落在SC-Leu-TrpHis+3AT 3种营养缺陷培养基平板上生长良好.证明CHD9与PA蛋白在酵母双杂交系统中具有较强的相互作用.CHD9的初步鉴定为研究AIV在机体中的复制过程奠定了基础. 相似文献
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为了筛选与禽呼孤病毒σA基因相互作用的宿主蛋白,本试验应用酵母双杂交技术构建禽呼孤病毒σA基因的诱饵载体pGBKT7-σA。从禽呼肠孤病毒S1133标准毒株抽提RNA,采用RT-PCR方法扩增得到σA基因片段,将其连接到诱饵载体pGBKT7上,把通过测序的重组诱饵载体命名为pGBKT7-σA。将重组诱饵载体转化酿酒酵母Y2HGold后,把不同浓度的诱饵载体转化液涂布在营养缺陷型培养基上,观察该重组诱饵载体在酵母细胞中有无毒性作用和自激活现象。结果显示,酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-σA构建成功,且对酿酒酵母无毒性和自激活现象。本研究为进一步利用酵母双杂交技术筛选与σA蛋白互作的宿主蛋白奠定了基础。 相似文献
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利用酵母双杂交技术筛选白细胞文库中与A型流感病毒PB1-F2相互作用的宿主蛋白,为研究PB1-F2蛋白的功能提供依据。构建pGBKT7-PB1-F2诱饵重组载体,在证实诱饵蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛选人白细胞文库中与PB1-F2相互作用的细胞蛋白。对阳性克隆进行测序和生物信息学分析,并在酵母细胞内验证蛋白的相互作用。Western blot结果表明,酵母表达载体pGBKT7-PB1-F2在酵母中成功表达PB1-F2融合蛋白。酵母双杂交筛选并验证,获得了8个与流感病毒PB1-F2蛋白相互作用的宿主蛋白。本研究有助于在分子水平上探索PB1-F2蛋白的新功能,为揭示流感病毒的致病机理奠定基础。 相似文献
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【目的】 探讨非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）衣壳蛋白E120R在病毒感染中的作用，确定与E120R蛋白互作的宿主蛋白。【方法】 将ASFV分离株CADC_HN09株E120R基因合成并克隆于pGBKT7表达载体，获得pGBKT7-E120R诱饵质粒，同时构建E120R基因截短表达质粒pGBKT7-E120R-1（1－61位氨基酸）和pGBKT7-E120R-2（62－122位氨基酸）。经毒性和自激活性检测后，通过酵母双杂交技术对骨髓巨噬细胞（BMDMs） cDNA均一化酵母文库进行初步筛选，以获得与ASFV E120R蛋白互作的蛋白。通过NCBI数据库进行序列比对并经免疫共沉淀试验验证，确定互作的宿主蛋白。筛选的宿主蛋白经webgenstal在线分析网站初步进行GO功能和KEGG通路富集分析，以确定所筛选的宿主蛋白参与的生物过程与信号通路。【结果】 诱饵质粒pGBKT7-E120R-2无毒性和自激活性，可用于文库筛选。通过酵母双杂交系统从BMDMs cDNA均一化酵母文库中初步筛选到46个阳性克隆并进行回转验证，经NCBI数据库序列比对分析共获得29个宿主蛋白。免疫共沉淀试验结果显示，多聚胞嘧啶结合蛋白2（PCBP2）和干扰素刺激基因15（ISG15）均与E120R蛋白存在互作。GO功能富集分析表明，所筛选的宿主蛋白可参与代谢过程、生物调节、应激反应等生物过程；KEGG通路富集分析表明，这些宿主蛋白可参与抗原呈递、铁死亡和坏死性凋亡等多条信号通路。【结论】 ASFV E120R蛋白可与宿主免疫应答、细胞死亡等信号通路相关的多种宿主蛋白互作，为进一步研究ASFV E120R蛋白在病毒感染过程中的作用提供了重要理论依据。 相似文献
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柞蚕抗菌肽D基因在酵母中表达的研究 总被引：8，自引：2，他引：6
柞蚕抗菌肽具有广谱杀菌功能，人工合成抗菌肽Ｄ基因（１２２ｂｐ）与含α－因子及前导肽序列的穿梭质粒ｐＣＬＷＡ２重组，克隆于酵母ＡＢ１０３。在缺亮氨酸的ＹＥ培养基中筛选Ｌｅｕ＋阳性的转化子。转化子菌株培养扩增后提取重组质粒与抗菌肽基因片段探针作点杂交为阳性，电泳后插入含抗菌肽Ｄ基因１２８ｂｐ的区带。在转基因酵母的发酵液中分离上清液，浓缩，对抗菌肽敏感的指示菌Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２Ｄ３１有明显抑菌效应。证实人工合成柞蚕抗菌肽Ｄ基因在酵母中表达。 相似文献