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为建立猪圆环病毒3型(PCV3)荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中PCV3基因序列设计特异性引物和探针,经过反应体系和条件优化,建立了特异性检测PCV3的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。该检测方法在4.78×10~1拷贝/μL～4.78×10~9拷贝/μL质粒标准品范围内均有良好的线性关系;该方法特异性试验结果显示,其与多种常见猪病病毒均无交叉反应,特异性良好;本研究建立的方法敏感性是常规PCR方法的100倍,敏感性较高;批内批间重复性试验变异系数均小于2.3%,重复性良好。对临床样品的检测结果显示,该方法对PCV3的检出率高于常规PCR方法,并且PCV3阳性样品多存在混合感染情况。该方法的建立为PCV3的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。 相似文献
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猪圆环病毒3型PCR检测方法的建立及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
《中国预防兽医学报》2017,(9)
为建立一种用于检测猪圆环病毒3型(PCV3)的PCR方法,本研究针对Gen Bank中PCV3全基因序列在其保守区设计一对特异性引物,并优化反应条件,建立了PCV3的PCR检测方法。结果显示,该PCR方法仅对PCV3检测为阳性,而对其它常见病原的DNA模板均无扩增。对PCV 3的最低检出量为61.9拷贝/μL。结果表明该方法具有良好的特异性和敏感性。通过该方法对133份临床样品进行检测,结果显示PCV3阳性率为29%(38/133),表明PCV3在河南地区已有流行。该方法的建立使PCV3的检测更为快速、简便、经济、实用,为PCV3感染的早期诊断提供了有力的技术支持。 相似文献
3.
为建立快速、简便检测猪圆环病毒3型(PCV3)的方法。本研究根据GenBank中已登录的PCV3 ORF1基因序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了检测PCV3的TaqMan荧光PCR检测方法。结果显示,该方法特异性好,不与其他常见猪病病原体发生交叉反应,检测PCV3灵敏度可达12拷贝/μL,本试验建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法可对PCV3进行快速诊断,适合现场检测,为PCV3相关疾病的诊断和防控奠定了基础。 相似文献
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5.
为建立同时检测PCV3和PCV2的二重PCR方法,分别以PCV3和PCV2基因组的保守区域设计2对特异性引物,片段大小分别为649,295 bp。将反应条件进行优化,构建PCV3和PCV2的二重PCR检测方法。检测结果表明该方法能特异性扩增PCV3和PCV2,且无法扩增其他猪常见病毒;PCV3和PCV2的最低检出限分别为508,412 copies/μL。临床样品检测结果显示,PCV3和PCV2阳性率分别为2.1%(3/145),62.1%(90/145),PCR产物经测序证实为PCV3。本研究建立的二重PCR方法具有速度快、特异性强和灵敏度等优点,可以用于PCV3和PCV2的检测和流行病学调查。 相似文献
6.
猪圆环病毒2型和3型双重PCR检测方法的建立及应用 总被引：2，自引：0，他引：2
建立一种能够同时快速检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重PCR方法,为猪圆环病毒病的快速诊断及流行病学的研究提供技术支持。根据Gen Bank中报道的PCV2和PCV3毒株全基因序列,在建立各病毒单项PCR检测方法的基础上,筛选双重PCR反应的最佳条件。扩增两种病毒的片段分别为1 154 bp和649 bp。建立的PCV2/3双重PCR检测方法的最佳退火温度为55℃,最佳引物终浓度为1. 0pmol/μL。应用建立的双重PCR方法和单项PCR方法分别对73份临床猪病料进行PCV2和PCV3检测,对结果进行对比分析,结果显示两者的符合率为100%。经初步临床应用,所建立的双重PCR检测方法可用于对PCV2和PCV3的同时鉴别检测。 相似文献
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为了检测猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus 2,PCV2)并对其进行准确定量,试验根据PCV2基因序列设计引物和探针,建立了一种特异性检测PCV2的TaqMan荧光定量方法。结果表明:该方法特异性良好;在5.0×10~1～5.0×10~9拷贝/μL模板范围内具有良好的线性关系;敏感性是常规聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法的100倍;重复性试验变异系数小于1.5%。与常规PCR方法相比,该方法对临床样品的检出率更高。该方法的建立为PCV2的实验室诊断、流行病学调查以及研究PCV2核酸载量与临床致病性关系提供了快速、准确的检测依据。 相似文献
8.
猪圆环病毒2型和3型双重PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
《中国兽医学报》2019,(1):25-30
猪圆环病毒3型(PCV3)是一种新的猪圆环病毒,与猪皮炎和肾病综合征、母猪繁殖障碍及心脏和多系统炎症相关。为了建立一种同时快速检测猪圆环病毒2型(PCV2)和PCV3的双重PCR方法,根据GenBank收录的PCV2和PCV3基因序列,分别在PCV2 Cap基因和PCV3 Rep基因高度同源保守区设计并筛选2对特异性引物,经过双重PCR反应条件的优化,建立了同时检测PCV2/3的双重PCR检测方法。本方法可同时扩增出PCV2、PCV3的486,270bp特异性片段,而扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)等病原核酸结果均为阴性;PCV2/3最低检出量分别为139,21.7拷贝/μL。经临床应用表明,本试验建立的双重PCR方法简便、快速,敏感度高,特异性强,为PCV2/3的鉴别诊断和联合检测提供了依据。 相似文献
9.
为建立可同时鉴别检测非洲猪瘟病毒(ASFV)以及猪圆环病毒2型(PCV2)、3型(PCV3)的三重PCR方法,根据GenBank中登录的ASFV、PCV2、PCV3相关基因保守序列,分别设计合成特异性引物,通过对引物浓度、退火温度、循环数等反应条件进行优化,建立了针对3种病原的三重PCR检测方法,并开展了敏感性、特异性及重复性试验。结果显示:引物最佳终浓度为0.375 pmol/μL,最佳退火温度为61℃,最佳循环数为35;该方法对ASFV、PCV2、PCV3的扩增目的条带分别为873、530和217 bp,对猪细小病毒和伪狂犬病病毒的扩增结果均为阴性;对ASFV、PCV2、PCV3重组质粒标准品的检出下限均为1×104 copies/μL;相同条件下重复性试验获得均匀一致的结果。结果表明,本研究建立的三重PCR检测方法具有特异性强,敏感性及重复性好等优点,可用于ASFV、PCV2和PCV3感染的快速鉴别诊断及流行病学调查。 相似文献
10.
应用复合PCR法检测猪圆环病毒 总被引：31，自引：2，他引：29
根据基因库中猪圆环病毒（PCV）的基因序列设计引物，建立复合PCR方法，对2株PK－15细胞进行了PCV检测。结果2株PK－15细胞都可扩增出PCV－1的基因片段，其中1株还扩增到了PCV－2的DNA片段。由此可见，应用设计的引物进行复合PCR快速检测PCV是可行的，这为PCV的检测、分型及PCV相关疾病的诊断奠定了基础。 相似文献
11.
为了解猪圆环病毒3型(PCV3)在云南省不同地区猪群中的流行情况,针对PCV3基因保守区域设计特异性引物,优化反应条件,建立PCR快速检测方法,并采用该方法对采自云南省不同地市431份样品进行检测,将获得的部分毒株全基因序列进行遗传进化分析。结果显示:本研究成功建立了一种快速、特异和灵敏的PCV3检测方法;云南省12个地(市)29县(区)中,8个地(市)12个县(区)检测出阳性样品;431份样品中有43份PCV3阳性样品,阳性率为9.98%;获得的3株PCV3全基因组序列与参考毒株之间的核苷酸同源性为98.6%~99.5%,进化树显示3株云南毒株形成一个小的进化分支,属于PCV3a基因型。本研究结果表明,PCV3在云南省多个地区呈一定的流行趋势,流行毒株以PCV3a基因型为主,有必要进一步开展云南地区PCV3流行病学调查,并提出防控对策。 相似文献
12.
目的建立猪圆环病毒2型(PCV2)的快速PCR检测方法,并对规模化猪场进行流行病学调查。方法对疑似患有典型断奶仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)的病猪进行病理学观察,针对猪圆环病毒2型开放阅读框2(ORF2)设计特异性引物进行PCR检测,建立PCR快速检测方法。对四川地区的规模化猪场进行PCV2的流行病学调查。结果建立的PCR技术可以快速检测样品中PCV2病原,可重复性好。应用此方法对9个规模化猪场的104份样品进行检测。结论 PCV2感染在规模化猪场的存在比较普遍,本研究为进一步开展疫病的检测和进行PCV2流行病学调查奠定了基础。 相似文献
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为了解猪圆环病毒3型(PCV3)在北京市不同区县猪场中的流行情况,研究建立PCR检测方法,对来自北京市8个区县56个养殖场的1177份临床样品进行检测,并对获得的部分ORF2全基因序列进行遗传进化分析。结果显示,PCV3总体阳性率为1.0%(12/1177),猪场阳性率为8.9%(5/56)。对PCV3阳性样本进行ORF2基因测序及同源性比对,共测得12株PCV3 ORF2全长基因序列,其中包括6株不同的ORF2全长基因序列。结果显示,该6株序列之间的核苷酸相似性为97.7%～99.5%,推导氨基酸序列的相似性为97.2%～100%;与参考毒株之间的核苷酸同源性为96.0%～99.5%,推导氨基酸同源性为92.1%～100.0%;进化树显示北京毒株属于PCV3b基因型。试验表明,PCV3在北京多个猪场呈现一定的流行趋势,流行毒株以PCV3b基因型为主。 相似文献
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为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV美洲型经典株、高致病性变异株以及TJM-F92疫苗株的Nsp2基因序列特点,设计2对特异性引物。经优化反应条件后,建立了能同时检测并区分PRRSV美洲型经典株、变异株及疫苗株的多重RT-PCR方法。该方法特异性强,与猪其他病毒间不存在交叉反应;敏感性高,对重组质粒标准品的检出下限为1.13×103拷贝/μL。应用所建立的方法对349份临床疑似病料进行检测,结果检出PRRSV阳性119份,其中美洲型经典株5份、变异株107份、TJM-F92疫苗株7份,且有变异株和TJM-F92疫苗株混合阳性7份。表明本研究成功建立了PRRSV美洲型经典株、变异株及TJM-F92疫苗株的多重RT-PCR鉴别检测方法,可用于PRRSV的临床检测及流行病学调查。 相似文献
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Two pairs of primers used to respectively amplify transmissible gastroenteritis virus (TGEV) S gene and porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) M gene were designed to develop a method of differential diagnosis of TGEV and PEDV.The established double PCR could detect S gene of TGEV with the length of 299 bp and M gene of PEDV with the length of 437 bp.Negative results using CSFV,PCV2,PRRSV and PRV as control were obtained.The detection limit of this method was 104 copies/μL.68 clinical samples collected from swine farm were submitted to detect TGEV and PEDV,and the result showed that the established double PCR method with the characteristics of high sensitivity and high specificity could be widely used in clinical diagnosis and epidemiological investigation. 相似文献
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通过对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因和猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因进行序列分析,本试验利用DNAStar软件分别设计2对特异性引物,扩增片段长度分别为299和437 bp,建立一种针对TGEV和PEDV感染的二重PCR鉴别诊断方法.该方法能同时检测到TGEV和PEDV,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等均无扩增,其检测TGEV、PEDV的极限为104 拷贝/μL;用该方法对临床收集的68份疑似病毒性腹泻仔猪粪便和肠道组织样本进行检测,结果表明本试验建立的二重PCR方法具有特异性强、灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查. 相似文献
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对广东省不同地区新生仔猪先天性震颤猪群中PCV3的流行病学情况进行调查。采集的病料样品,通过常规PCR进行PCV3检测与全基因扩增,分析其全基因的遗传进化关系。将获得的16株PCV3毒株核酸序列与其他环状病毒参考毒株对全基因组和Cap基因进行遗传变异分析,结果显示,新生仔猪的先天性震颤猪群中PCV3样本总阳性率高达58.2%。16株PCV3毒株之间全基因核苷酸序列同源性为99.5%~100%,与美洲代表毒株PCV3-US/MO2015全基因核苷酸序列同源性在98.8%~99.1%之间;16株PCV3毒株之间Cap基因的核苷酸序列同源性为99.7%~100%,与国内外参考毒株的核苷酸同源性为99.1%~100%。遗传进化分析显示,16株PCV3毒株都属于PCV3a分支。PCV3在我国广东省新生仔猪先天性震颤猪群中广泛存在。 相似文献
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猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
本研究以猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白ORF2基因为目的基因,设计合成特异性引物和探针。PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体,筛选得到标准阳性质粒。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了PCV2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异性强,对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)等猪常见病原的检测结果均为阴性;与普通PCR方法相比,其敏感性高出100倍,可达100拷贝/μL;对临床样品的检测证明,该方法可有效检测出淋巴结、肺脏等组织中的PCV2。 相似文献
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LIANG Lin PANG Chun-hua LUO Ya-kun ZHOU Ling WANG Jing LIU Chang LIU Qi CUI Shang-jin 《中国畜牧兽医》2017,44(12):3440-3445
This study was aimed to establish a duplex nanoparticle-assisted PCR (nano-dPCR) method for the simultaneous detection of porcine circovirus type 2 (PCV2) and PCV3, and to apply this method in the detection of PCV2 and PCV3. Primers specific to PCV2 and PCV3 were designed by reference to the respective gene sequences in GenBank. The reaction conditions of nano-dPCR were also optimized. An evaluation of the specificity and sensitivity of the established nano-dPCR protocol proved the method to be both specific and sensitive, with the lower detection limit for the amount of nucleic acid in PCV2 and PCV3 to be 93.2 and 91.6 copies/μL, respectively. This sensitivity was 100 times higher than that of conventional PCR. The method was applied to inspect 265 clinical samples sent for testing, and the results showed that PCV2 and PCV3 infection in pig was rather common, with 16.6% positive for PCV3, 14.7% positive for PCV2, and 6.8% for mixed infection. The detection results on clinical samples supported the newly established nano-dPCR method as a rapid and sensitive differential diagnosis for the early infection of PCV2 and PCV3. 相似文献
20.
本研究旨在建立一种同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）和猪圆环病毒3型（PCV3）的双重纳米PCR（nano-dPCR）方法,同时应用该方法对PCV2和PCV3进行检测。参考GenBank中登录的PCV2和PCV3型基因序列分别设计特异性引物,对nano-dPCR的反应条件进行优化;同时考察所建立的nano-dPCR检测方法的特异性和敏感性。结果显示,所建方法的特异性和敏感性良好,对PCV2和PCV3两种病毒的最低核酸检测量分别为93.2和91.6拷贝/μL,其敏感性比普通PCR高100倍。应用该方法对送检的265份临床样本进行检测,结果显示,PCV2和PCV3在猪群中存在普遍感染,PCV3和PCV2的阳性率分别为16.6%和14.7%,混合感染阳性率为6.8%。临床样品的检测结果表明,本试验建立的nano-dPCR方法为PCV2和PCV3早期感染进行快速、敏感鉴别诊断提供了新方法。 相似文献