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1.
利用前期构建的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株与各自母株之间的抑制性消减文库而获得的ESTs序列,选择其中一个差异表达的EST序列（克隆号为M20）,采用RACE技术,以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA为模板,扩增获得了该基因的全长cDNA序列,命名为M20,该基因全长847 bp,包括一个525 bp的开放阅读框,编码174个氨基酸,预测理论分子量约为19 ku。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在敏感株中表达量高于地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株;在不同发育阶段中,未孢子化卵囊表达量高于孢子化卵囊、子孢子以及裂殖子阶段虫体。将该基因克隆于原核表达质粒pET28b中,构建重组质粒pET28b-M20,转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经IPTG诱导表达获得了重组蛋白,分子量约约为23 ku,该蛋白以包涵体形式存在,在IPTG诱导8 h后表达稳定,Western blot检测表明,其具有较好的免疫原性。 相似文献
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利用前期构建的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株与各自母株之间的抑制性消减文库而获得的ESTs序列,选择其中一个差异表达的EST序列(克隆号为M20),采用RACE技术,以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA为模板,扩增获得了该基因的全长cDNA序列,命名为M20,该基因全长847 bp,包括一个525 bp的开放阅读框,编码174个氨基酸,预测理论分子量约为19 ku。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在敏感株中表达量高于地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株;在不同发育阶段中,未孢子化卵囊表达量高于孢子化卵囊、子孢子以及裂殖子阶段虫体。将该基因克隆于原核表达质粒pET28b中,构建重组质粒pET28b-M20,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导表达获得了重组蛋白,分子量约约为23 ku,该蛋白以包涵体形式存在,在IPTG诱导8 h后表达稳定,Western blot检测表明,其具有较好的免疫原性。 相似文献
3.
为探讨抗球虫药物地克珠利和马杜拉霉素对柔嫩艾美球虫18SrDNA的影响，分别对人工诱导的柔嫩艾美球虫地克珠利抗药株（ETAD）、马杜拉霉素抗药株（ETAM）和药物敏感株（ETDS）孢子化卵囊的18SrDNA基因进行了克隆测序，并通过生物信息软件进行对比差异分析。结果显示，ETAM株有3个碱基发生突变（T170突变为C，T646突变为C，G694突变为C）；ETAD株有1个碱基发生突变（T646突变为C）。经进一步分析比较，发现ETAM株18SrRNA的二级结构与ETDS株的差异很大，而ETAD株18SrRNA的二级结构则与ETDS株的完全相同。这些碱基的突变有可能是导致E．tenella产生抗药性的原因之一。 相似文献
4.
柔嫩艾美球虫抗药株第二代裂殖子的双向电泳图谱比较 总被引：8，自引：0，他引：8
对实验室诱导的柔嫩艾美球虫马杜拉霉素、地克珠利抗药株及其同母源敏感株第二代裂殖子的蛋白质进行双向电泳，构建了稳定的双向电泳图谱。经Imagemaster 2D Elite软件分析，敏感株和抗药株平均可分离900个点；以敏感株平均胶作为参考胶，抗药株平均胶与之比较，得到差异蛋白质斑点，其中地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株各有4个表达差异点。这些差异表达的蛋白质可能参与了球虫抗药性产生的过程。 相似文献
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6.
柔嫩艾美耳球虫地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株的实验室诱导 总被引：11，自引：1，他引：11
采用药物浓度逐渐递增的方法 ,以 0 .0 5× 10 - 6 地克珠利和 2 .0× 10 - 6 马杜拉霉素为起始诱导浓度 ,分别经过 18次和 2 0次传代 ,在实验室诱导了柔嫩艾美耳球虫 (Eimeria tenella)对地克珠利和马杜拉霉素的抗药性虫株。经抗药性检测 ,以最适抗球虫指数 (POAA)、病变记分减少率 (RL S)、相对卵囊产量 (ROP)和抗球虫指数 (ACI) 4项指标综合判定及综合抗药性指数 (GI) 2种方法共同判定 ,获得的地克珠利抗药株对 1.2× 10 - 6地克珠利具有完全抵抗力 ,而对马杜拉霉素完全敏感 ;马杜拉霉素抗药株对 7.0× 10 - 6 的马杜拉霉素具有完全抵抗力 ,而对地克珠利完全敏感。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2016,(6)
为检测实验室长期保存的柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素抗药株和地克珠利抗药株的遗传稳定性,采用鸡体试验法,以抗球虫指数、最适抗球虫活性百分率、病变记分减少率和相对卵囊产量4项指标,评价2个抗药株对地克珠利、癸氧喹酯、马杜拉霉素等3种抗球虫药物的抗药性,并以柔嫩艾美耳球虫敏感株为对照。结果显示,柔嫩艾美耳球虫敏感株对3种抗球虫药物均无抗药性,4项指标全部阴性。柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素抗药株对马杜拉霉素为完全耐药,4项指标全部阳性;对地克珠利、癸氧喹酯则表现为无抗药性,4项指标全部阴性。柔嫩艾美耳球虫地克珠利抗药株对地克珠利表现为完全耐药,4项指标全部阳性;对马杜拉霉素表现为中度耐药,2项指标阳性;对癸氧喹酯则表现为无抗药性,4项指标全部阴性。结果表明,在实验室已繁殖保存10余年的柔嫩艾美耳球虫2个抗药虫株对其诱导药物具有明显抗药性,实验室保种繁殖方法可行,虫株遗传稳定性良好,为利用该虫株进行球虫抗药性机制等相关研究奠定了基础。 相似文献
8.
鸡球虫病是由艾美耳球虫引起的一种危害严重的肠道寄生虫病,每年都会给世界各地的养禽业带来巨大的经济损失。目前,该病主要依靠抗球虫药物进行防治,但由于药物的长期及不合理使用导致鸡球虫几乎对所有使用过的抗球虫药均产生耐药性。为研究球虫耐药性产生的分子机制,本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株以及敏感株进行了转录组测序并获得了敏感株与耐药株的差异表达基因,发现柔嫩艾美耳球虫含HD域蛋白（EtHDCP）在耐药株中上调表达。本研究以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA第一链为模板,成功克隆出EtHDCP基因,构建了原核表达重组质粒pGEX-4T-EtHDCP,并成功诱导表达了重组蛋白rEtHDCP。利用qRT-PCR和Western blot对柔嫩艾美耳球虫敏感株不同发育阶段的转录和翻译水平进行分析,结果显示,EtHDCP在第二代裂殖子的转录和翻译水平高于其他三个阶段（未孢子化卵囊、孢子化卵囊和子孢子）。同时利用Western blot分析了EtHDCP在柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株中的翻译水平,结果显示,EtHDCP在耐药株中的蛋白翻译水平显著高于敏感株。间接免疫荧光定位结果显示,该蛋白主要定位在子孢子和裂殖子的表面以及裂殖子的胞质内。入侵抑制试验表明,抗rEtHDCP多克隆抗体可有效抑制子孢子对宿主细胞的入侵。这些结果说明该蛋白可能参与了虫体在宿主细胞内的生长发育、耐药性的产生以及子孢子入侵宿主细胞的过程。 相似文献
9.
采用药物浓度递增法,以0．07mg／L地克珠利为起始诱导浓度连续传代,以最适抗球虫指数（POAA）、病变记分减少率（RLS）和相对卵囊产量（ROP）3项指标综合判定抗药性。经12次传代,该诱导虫株对1．5mg／L地克珠利具有完全抵抗力。试验结果表明,用实验室方法诱导柔嫩艾美耳球虫抗药株完全可行。 相似文献
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柔嫩艾美耳球虫对四种抗球虫药的交叉抗药性试验 总被引：20，自引：4，他引：16
为了测试柔嫩艾美耳球虫的４种抗药虫株（抗地克珠利、抗拉沙里菌素、抗盐霉素和抗克球粉虫株）对４种抗球虫药（地克珠利、拉沙里菌素、盐霉素和克球粉）的敏感性进行了本试验。结果表明：柔嫩艾美耳球虫地克珠利抗药虫株对拉沙里菌素、盐霉素和克球粉均表现敏感,拉沙里菌素抗药虫株、盐霉素抗药虫株和克球粉抗药虫株对地克珠利也表现为高度敏感,因此,柔嫩艾美耳球虫对地克珠利与拉沙里菌素、地克珠利与盐霉素、地克珠利与克球粉３组药物不存在交叉抗药性。 相似文献
11.
Chicken coccidia are protozoan parasites of the genus Eimeria. They cause economical losses in the poultry industry globally. The various species can be distinguished on the basis of the morphology of the oocysts and parasitic site in intestine, but these criteria sometimes are unreliable. Therefore, a species-specific polymerase chain reaction (PCR) was developed. Based on variable sequence regions, specific primers were constructed for the differentiation of five Eimeria species (Eimeria acervulina, E. brunette, E. maxima, E. necatrix, and E. tenella). PCR products were amplified from coccidian vaccine (coccivac-D and coccivac-B) and E. tenella and were subsequently sequenced. Similarities of the five species sequences between the vaccines and Genbank were 94-100%. Analysis of the E. tenella internal transcribed spacer 1 (ITS-1) partial sequence from Taiwan and from Genbank indicated that the similarity was 99.6%. The PCR sensitivity test of E. tenella in Taiwan is 50 oocysts. The five sets of primers will not amplify any non-specific bands of the chicken genome or its intestinal contents. Therefore, the five sets of specifically designed primers are guaranteed to be useful for differential diagnosis of avian coccidiosis caused by Eimeria spp. 相似文献
12.
为了获得我国斯氏艾美耳球虫长春株ADF基因并分析其与柔嫩艾美耳球虫长春株相应序列的同源性,试验根据GenBank中公布的柔嫩艾美耳球虫ADF基因序列设计引物,采用RT-PCR方法获得我国斯氏艾美耳球虫长春株ADF基因部分序列,然后将其克隆到pMD18-T载体中,应用DNAStar软件对测得序列进行序列分析。结果表明:斯氏艾美耳球虫长春株ADF基因大小为357 bp;经DNAStar分析,我国斯氏艾美耳球虫长春株与柔嫩艾美耳球虫长春株ADF核苷酸序列和氨基酸序列同源性均为99.2%。说明ADF基因在进化过程中高度保守。 相似文献
13.
为了确定鸡艾美耳球虫（Eimeria）不同种以及来自不同地区同种不同株之间的亲缘关系,研究其分类地位,对实验室保藏的柔嫩艾美耳球虫（Etenella）、毒害艾美耳球虫（Eneeatrix）、巨型艾美耳球虫（Emaxima）、堆形艾美耳球虫（Eaaervulina）等4种15株鸡球虫孢子化卵囊的18SrDNA基因进行克隆、测序,并与从GenBank下载的鸡球虫18SrDNA序列一起,使用软件DNAstar 5．0 MegAlign进行系统发育分析。结果显示,4种艾美耳球虫种间同源性在94．6％～99．4％之间,7株柔嫩艾美耳球虫的株间同源性在99．0％-99．9％之间,5株巨型艾美耳球虫的株间同源性在96．9％～99．8％之间。用该4种鸡球虫的18SrDNA序列与GenBank下载的另外4种鸡球虫18SrDNA序列构建系统发育树,显示这8种鸡艾美耳球虫形成2个分支,即堆形艾美耳球虫（EASH）、巨型艾美耳球虫（EMSH）、变位艾美耳球虫（Emivati）、和缓艾美耳球虫（Emitis）、布氏艾美耳球虫（Ebrunetti）、早熟艾美耳球虫（Epraecox）构成1个分支,柔嫩艾美耳球虫（ENSH）、毒害艾美耳球虫（ETAS）构成另1分支。巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫各株的系统发育树均根据地域关系产生2个分支。柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫的亲缘关系较近,不同地理区域的同种不同株的亲缘关系相对较远,种间和种内的鉴定结果与普通生物学结果一致。本研究提示18SrDNA基因可用于鸡球虫不同种／株的分类鉴定,为艾美耳球虫分子遗传学鉴定提供了理论基础。 相似文献
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Tsuji N Ohta M Kawazu S Kamio T Isobe T Shimura K Fujisaki K 《The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science》1999,61(12):1331-1333
DNA polymorphism in twelve starains of Eimeria tenella isolated from various places in Japan was examined using 1.l kb small subunits ribosomal RNA amplified by PCR. Genetic variation was evaluated by random amplification of polymorphic DNA (RAPD) analysis. DNA fingerprint patterns were grouped into two, indicating that at least two DNA polymorphisms exist in Japanese E. tenella strains. 相似文献
15.
Lien YY Sheu SC Liu HJ Chen SC Tsai MY Luo SC Wu KC Liu SS Su HY 《Veterinary journal (London, England : 1997)》2007,173(1):184-189
Coccidiosis of chickens caused by protozoan parasites of the genus Eimeria (Coccidia: Eimeriidae) is an enteric disease that results in great economic losses throughout the world, including Taiwan. Using polymerase chain reaction (PCR) with primers specific for the second internal transcribed spacer (ITS-2) of ribosomal DNA (rDNA), three species of Eimeria, E. tenella, E. maxima, and E. acervulina have been successfully characterised from chickens in Taiwan. The sizes of PCR products from various isolates representing these three species were between 370 and 580 base pairs (bp). After cloning and sequencing of the PCR products, high nucleotide sequence identity (96.8-100%) was observed within a species. In addition, ITS-2 nucleotide sequences for E. tenella had higher homology (98.5-99.3%) than E. maxima (81.6-96.5%) when compared with appropriate sequences deposited in GenBank. To our knowledge, this is the first report of a 412-bp ITS-2 sequence for E. acervulina from chickens. 相似文献
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柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG2基因的克隆与表达 总被引：1，自引：0，他引：1
根据生物信息学预测的基因序列设计引物,应用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA扩增获得了鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原2(surface antigen 2,SAG2)基因序列,将其与pGEM-T easy载体连接后转化E.coliDH5α,筛选阳性克隆,以带有限制酶切位点的特异性引物用PCR方法扩增不含SAG2 N端信号肽序列的ORF序列后克隆至表达载体pET-32 a(+),构建了重组表达质粒pET-32 a(+)-SAG2,并将其转化至E.coliBL21(DE3)。经IPTG诱导,获得了SAG2重组抗原在大肠杆菌的高效表达,重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,融合蛋白的分子量约为47 ku。菌体经超声处理后进行SDS-PAGE分析表明,表达蛋白以包涵体的形式存在。 相似文献
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柔嫩艾美耳球虫野外抗药性虫株的RAPD分析 总被引：9，自引：0，他引：9
用RAPD方法对柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）的8个分别来源于黑龙江、北京、四川、甘肃和广东的中山、新会、东莞以及广州近郊的江村镇的野外分离虫株和2个药物敏感性虫株进行了遗传多态性分析。同时用9种抗球虫药物即马杜霉素（5mg/kg）、盐霉素（60mg/kg）、莫能霉素（120mg/kg）、拉沙菌素（90mg/kg）、克球多（150mg/kg）、常山酮（3mg/kg）、氯氢苯乙氰（1mg/kg）、尼卡巴嗪（125mg/kg）和球痢灵（125mg/kg）分别对8个野不进行抗药性试验，8个虫株对上述药物均有不同程度的抗药性。RAPD分析表明：10个样品都有相似而清晰的主带，每个泳道有5－13条带不等，大小为0.18-2.10kb。它们之间的相似率（SI）大于40.58%，最大的为90.72%，这种相似率属种内变异水平。根据SI值可把10个样品划分为3个类群：广东虫株类群，群内比较，平均SI值为76.60%；广东省外虫株类群，群内比较的平均SI值72.14%；敏感株类群，其间的SI值为89.27%。在另一方面，广东株与广东省外株、敏感株之间比较，其SI的平均值分别仅为63.03%和47.25%，说明柔嫩艾美耳球虫抗药性虫株之间有遗传差异法。 相似文献