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应用复合PCR法检测猪圆环病毒 总被引：31，自引：2，他引：29
根据基因库中猪圆环病毒（PCV）的基因序列设计引物，建立复合PCR方法，对2株PK－15细胞进行了PCV检测。结果2株PK－15细胞都可扩增出PCV－1的基因片段，其中1株还扩增到了PCV－2的DNA片段。由此可见，应用设计的引物进行复合PCR快速检测PCV是可行的，这为PCV的检测、分型及PCV相关疾病的诊断奠定了基础。 相似文献
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猪圆环病毒PCV属于圆环病毒科,根据国外已经报道的猪圆环病毒的序列,设计了下面的一对引物,上游引物和下游引物(upper:5'-TTTTTATCACTTCGTAATGGTTTTT-3'lower:5'-GGCCCCCTTCCTCCGTG-GATTGTTC-3'),提取DNA,对PCV-2进行PCR试验.然后对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳.结果显示,从美国进口的种毒中扩增出了长为1768bp的基因片段.本试验可以从病料或全血中检测出PCV,且该方法能区分PCV-1和PCV-2,快速、敏感、特异性强,适合于PCV的检测. 相似文献
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应用PCR-RFLP方法对四川猪圆环病毒的检测与分型研究 总被引：3，自引：0，他引：3
根据GenBank中猪圆环病毒(PCV)的基因序列,设计并合成了1条引物,建立聚合酶链反应限制性酶切片段长度多态性分析(PCR RFLP)方法,对PK-15细胞、IBRS 2细胞以及疑似猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾炎综合征(PDNS)的病料进行了PCV检测,以及血清型的鉴定。结果表明:IBRS 2细胞和1个PMWS病料检测出PCV 1的基因片段,1个PMWS病料和1个PDNS病料检测出PCV 2基因片段。证明应用PCR RFLP快速检测PCV是可行的,为PCV的检测、分型以及PCV相关疾病的诊断奠定了基础。 相似文献
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猪圆环病毒复合PCR检测方法的建立 总被引：7，自引：0，他引：7
根据已发表的PCV—1和PCV-2全基因组序列，设计了3条引物，组成PCV-2的特有引物对和PCV-1、PCV-2的共有引物对，分别扩增长度为472bp和339bp的片段。为验证PCR扩增的特异性，将472bp的扩增产物纯化后，克隆到pMD18-T载体，转化大肠埃希氏菌TG1，对阳性克隆进行酶切及PCR鉴定，并测序。将该序列递交NCB1进行BL-AST同源序列比较，发现它与美国、加拿大及我国台湾的PCV-2毒株核苷酸序列的同源性均在99％以上，与PCV—1毒株的同源性为86％。结果显示，该方法最少可用于3μg病料组织和0．75pg DNA的PCV-2检出．具有很高的灵敏性。应用该PCR方法检测了浙江省和上海市47份“猪高热综合征”病料，PCV-2感染阳性率为36．17％，PCV—1单独感染阳性率为34．04％。 相似文献
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利用体外环化的猪圆环病毒2型(PCV-2)全基因的感染性,建立一种分离PCV-2的方法。根据GenBank中PCV-2的基因序列,设计合成1对扩增PCV-2全基因组的特异性引物。通过PCR方法从广东发病猪病料扩增到PCV-2全基因组片段,将该片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得阳性重组质粒pM-DT-YF并测序。将所测序列与GenBank中发表的PCV毒株序列进行同源性比较。将质粒pMDT-YF大量扩增,经SacⅡ酶切质粒得到PCV-2全基因组,通过T4连接酶体外环化后,脂质体介导转染PK-15细胞,盲传8代。用间接免疫荧光抗体试验(IFA)可检测到特异性荧光。将转染细胞稀释后接96孔细胞培养板,培养3 d。用荧光定量法检测各孔的PCV-2拷贝数,选择拷贝数最大的细胞扩大培养,经IFA法测定病毒滴度显著增加。结果表明,利用具有感染性的体外环化的全基因组的克隆转染PK-15细胞,并通过选择压力可获得较高滴度的具有感染性的PCV-2。 相似文献
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基于PCV2滚环复制原理,在分析PCV2不同基因亚型代表毒株基因组结构和序列的基础上,设计2对引物用于PCR扩增PCV2基因组序列。以从收集到的疑似PCV2感染的10份猪血清样品中提取的DNA为模板,用设计的引物扩增目的片段,并进行测序分析,1株为PCV2a型,4株为PCV2b型,5株为PCV2d型。每种基因型毒株中各选取一个样本,利用上述2对引物进行PCR扩增,并将扩增产物克隆至pEASY-Blunt simple载体中,通过双酶切连接2个PCR片段,构建含有约1500 bp重叠序列的PCV2基因组的质粒。通过脂质体转染法将含PCV2全基因组的质粒转染至PK-15细胞进行病毒拯救,经PCR和IFA两种方法验证,证明成功拯救出3个基因型的PCV2毒株。通过对PCV2全基因组结构及序列分析,该方法同样适用于PCV2g、PCV2h基因型病毒的感染性克隆构建。本研究建立了一种基于反向遗传学技术的PCV2感染性克隆的构建方法,为开展PCV2的病原学研究提供了技术支持。 相似文献
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屠宰生猪PCV-2感染的检测与基因型分析 总被引：1，自引：1，他引：0
为了解屠宰生猪中猪圆环病毒2型(PCV-2)的带毒状况及PCV-2的主要基因型,在分析PCV-2分离株基因序列的基础上分别设计了检测PCV-2、PCV2-A和PCV2-B的引物,建立了各自的PCR检测方法。结果表明,建立的PCV-2、PCV2-A、PCV2-B的PCR检测方法,特异性较好,可用于临床病料的检测;通过对临床采集的49分生猪血样的检测发现,PCV-2的阳性率为24.49%,均属于PCV2-B。检测结果表明,当地检测猪群中感染的PCV-2主要为PCV2-B毒株,在该病的防控方面应引起注意。 相似文献
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猪圆环病毒Ⅱ型Rep基因在PK15细胞中的表达及特性 总被引：3，自引：1，他引：3
为研究猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Rep基因在PK15细胞中的表达特性，通过PCR方法克隆了PCV2杭州株(HZ0201)Rep基因全长945bp片段，与真核表达栽体pCI—neo构建为重组质粒pCI-PCV2-Rep。pCI-PCV2-Rep质粒转染PK15细胞后48h，通过RT-PCR可检测到PCV2 Rep mRNA的转录；用猪PCV2多抗血清作间接免疫荧光试验，可检测到Rep基因表达产物。在表达量低的细胞中，PCV2 Rep蛋白主要位于PK15的细胞浆，在表达量高的细胞中，细胞浆和细胞核中均含有大量的Rep蛋白，表明Rep对PK15细胞的细胞浆和细胞核的亲嗜性没有明显差别。 相似文献
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为了构建Rep蛋白真核表达质粒，研究PCV2复制过程中的亚细胞分布。本研究借助PCR方法扩增PCV2的Rep基因，并将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C3中，并转染PK15细胞和Vero细胞。结果显示，重组的pEGFP—PCV2-Rep融合蛋白能够在PK15细胞和Vero细胞中表达。结论认为pEGFP—PCV2-Rep质粒转染PK15细胞和Vero细胞后48h，PCV2的Rep蛋白主要定位在PK15细胞和Vero细胞的细胞核。 相似文献
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为了解2013年-2015年辽宁地区猪圆环病毒2型(PCV2)的遗传变异情况,采用PCR对辽宁地区采集到PCV2阳性病料样品进行全基因组扩增,并应用DNA Star软件进行序列比对和遗传演化分析.结果表明,检测的15株PCV2全基因组全长为1 767 bp和1 768 bp,基因核酸序列同源性为94.4％～99.8％;15株PCV2毒株中有11株属于PCV2b基因型,4株属于PCV2a基因型.结果表明,目前在辽宁地区有多种血清型PCV2同时流行,应该针对优势血清型制定免疫策略. 相似文献
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为建立一种用SYBR Green I荧光染料检测PK 15细胞α干扰素(α IFN)效应因子Mx1、OAS的mRNA表达水平的qPCR检测方法，通过在猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus Type 2, PCV2）抑制α IFN发挥效应的信号通路中进行初步应用。根据GenBank中目的基因的序列，利用分子生物学软件Premier 5.0在其保守区设计并合成相应的特异性引物。利用TRIzol法提取总RNA，经Oligo d(T)15进行反转录，利用PCR扩增各段目的基因，并克隆至pMD 18 T载体，转化大肠杆菌DH 5α，经鉴定为阳性的重组质粒作为标准品模板建立SYBR Green I qPCR标准曲线和溶解曲线，并进行灵敏性、特异性和重复性试验。根据建立的实时qPCR方法，检测PCV2对α IFN效应因子的抑制效果。对建立的PK 15细胞α IFN效应因子SYBR Green I qPCR方法进行分析，结果表明Mx1、OAS和内参β actin基因的Ct值与标准品稀释度在1×101～1×108 copies/μL的范围分别呈良好的线性关系。PK 15细胞在接种PCV2，并受到α IFN刺激后Mx1、OAS的相对表达量较未接种PCV2明显降低。本试验建立了PK 15细胞α IFN效应因子的qPCR检测方法，为在mRNA水平上对PK 15细胞α IFN效应因子的定量分析奠定了基础，并成功地初步应用于PCV2抑制α IFN发挥效应的信号通路研究中。 相似文献
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Retrospective serological survey of antibodies to porcine circovirus type 1 and type 2. 总被引：15，自引：2，他引：13 
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下载免费PDF全文 A retrospective serological survey was performed to determine the presence of antibodies to porcine circovirus type 1 (PCV1) and porcine circovirus type 2 (PCV2) in serum samples collected from sows at slaughterhouses in Canada in 1985, 1989, and 1997. Each serum sample was tested by indirect immunofluorescence on PCV-free PK15 cells, on PCV1-infected PK15 cells and on PCV2-infected PK15 cells. For the 3 years studied, sera positive to PCV1 and PCV2 were identified and the number of sera positive for PCV2 was greater than the number of sera positive for PCV1. The results indicated 1) that PCV2 appears to be the main PCV type circulating in the Canadian pig population, 2) that PCV2 had been circulating in the Canadian pig population at least 10 years before the postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) was reported, and 3) that serological evaluation using PCV1 underestimates the seroprevalence of PCV2. 相似文献
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根据PCV2ORF2基因的序列设计两条引物从PCV2的PK15细胞培养物中扩增出ORF2基因(702 bp).将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,经酶切、测序鉴定筛选出重组质粒pMD-ORF2.将PCV2 ORF2基因克隆入pAdeasy腺病毒载体系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV中,获得重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-ORF2,将重组质粒与腺病毒骨架载体共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒pAdCMV-ORF2,然后用PacⅠ线性化后转染293细胞,在293细胞内包装出重组腺病毒.通过荧光显微镜观察、PCR检测和Western blot检测证明PCV2 ORF2基因在293细胞内获得表达,ORF2多肽具有良好的免疫原性. 相似文献
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根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)的核酸序列,设计了1对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪病料中扩增出了ORF3基因,将其克隆到高效真核表达载体pEGFP- N2中,筛选出含有ORF3基因的重组质粒,命名为pEGFP-N2-ORF3.对此重组质粒进行测序分析,结果表明,克隆的ORF3基因与其他PCV2的ORF3核苷酸序列相似性为96.2％-99.0％,氨基酸序列同源性为90.5 ％～98.1％.将重组质粒纯化后转染COS-7细胞,用PCR方法扩增出了特征性的基因片段,并采用特异性单抗进行间接免疫荧光,结果转染pEGFP- N2-ORF3重组蛋白在细胞核和细胞浆中均有表达,尤其在细胞核中表达量较高,且对细胞有一定的毒性.本研究为进一步探讨ORF3的结构和功能提供理论依据. 相似文献
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The materials from the clinical samples of kidney and inguinal lymph nodes characterized by postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) of the pigs,proved to be porcine circovirus type 2 （PCV2） positive samples through the amplification of ORF2 gene of PCV2, were inoculated into the PK-15 cells (PCV1 free) and serially passaged 10 times.Identifications were done by PCR method and immunofluorescent assay of the tenth generation of cell cultures, and the specific band could be amplified and a strong bright green fluorescence in the nucleus of PK-15 cells could be detected.The results demonstrated that the isolated strain named as FF strain belonged to PCV2. 相似文献