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[目的]原核表达牛病毒性腹泻黏膜病毒(BVDV)E2基因编码蛋白。[方法]采用PCR方法从BVDV中扩增E2基因片段,与原核表达载体pET-32a连接,构建重组表达质粒pET-32a-E2,转化E.coli(Rosetta)感受态细胞,重组菌用1 mmol/L IPTG诱导表达E2蛋白,进行SDS-PAGE电泳,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白,经Western blot分析鉴定免疫原性。[结果]重组质粒pET-32aE2经PCR及酶切鉴定证明构建正确,重组质粒能够在大肠杆菌中大量表达,表达产物的分子质量大小约为58 kDa,纯化后E2重组蛋白浓度0.521 mg/mL,Western blot分析表明,其能被BVDV阳性血清识别,具有很好的免疫原性。[结论]E2蛋白成功表达,为后续建立BVDV检测方法奠定了基础。 相似文献
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[目的]对牛传染性鼻气管炎病-毒(IBRV) gD基因表位进行原核表达,并对表达产物进行纯化鉴定.[方法]利用PCR扩增出gD基因3段表位即gD-A、gD-B、gD-C,并构建原核表达重组质粒pET-28a-gD.将其转入BI21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达.表达的gD重组蛋白经亲和层析纯化后,进行Western blot分析.[结果]重组表达质粒pET-28a-gD经PCR、双酶切及测序证明构建正确.SDS-PAGE表明,gD蛋白在大肠埃希菌中高效表达,表达的重组蛋白相对分子量约48 ku,与预期的蛋白分子量一致.纯化后的gD重组蛋白浓度为0.128mg//ml,免疫印迹结果显示纯化后的gD重组蛋白能与IBR标准阳性血清发生特异性反应,说明其免疫原性良好.[结论]成功表达了gD基因表位蛋白,该蛋白具有良好的反应原性,可作为预防IBR基因工程亚单位疫苗的候选抗原. 相似文献
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《西南农业学报》2016,(2)
为了分析绵羊肺炎支原体(MO)膜蛋白p56的反应原性,本研究以MO新疆流行株为模板,设计特异性引物对p56抗原集中区段进行PCR扩增,将扩增产物克隆测序,进一步亚克隆至表达载体pET-28a(+)中,构建pET-28a(+)-p56原核表达载体。将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG对重组菌进行诱导,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。结果表明,SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白相对分子量为44 kDa;Western blot分析表明该重组蛋白可与MO阳性血清发生特异性免疫学反应,证实表达的重组p56融合蛋白具有良好的反应原性,为进一步研发MO检测用抗原奠定了前期基础。 相似文献
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为了制备反应原性良好的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学诊断抗原,根据ASFV p30和p54基因序列,通过大肠杆菌密码子优化后分别体外合成全长的p30和p54基因,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)将2个基因片段串联,构建p30-54融合基因。将构建的融合基因片段克隆入p ET-28a(+)表达载体中,构建原核表达载体p ET-p30-54,转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导表达,检测融合蛋白的反应原性,并制备抗该融合蛋白的多克隆抗体。SDS-PAGE检测结果显示,表达的p30-54融合蛋白分子质量为47. 1 ku; Western blot分析显示,该融合蛋白可被ASFV阳性血清特异性识别,表明其具有良好的反应原性。将p30-54融合蛋白用Ni-NTA亲和层析柱纯化后免疫小鼠,成功制备了抗ASFV p30-54融合蛋白多克隆抗体。 相似文献
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《扬州大学学报(农业与生命科学版)》2016,(3)
根据Nectin-4基因序列设计特异性引物,进行PCR扩增,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,经PCR、酶切和测序鉴定,成功构建了重组表达质粒pGEX-4T-Nectin-4。将重组质粒转化大肠埃希氏菌Rosetta感受态细胞,经IPTG诱导表达目的蛋白。表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定正确后,纯化后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体血清,并利用琼脂扩散试验检测其效价。SDS-PAGE结果表明该重组蛋白获得高效表达,表达的蛋白以包涵体形式存在。Western blot结果表明表达的蛋白能与GST单抗发生反应,具有较好的反应原性。琼脂扩散试验结果表明制备的抗Nectin-4蛋白多克隆抗体效价达1∶8。由于Nectin-4是小反刍兽疫病毒新近发现的受体,这一研究为后续Nectin-4与小反刍兽疫病毒的相互作用研究奠定了一定基础。 相似文献
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【目的】克隆和表达羊口疮病毒(ORFV)的B2L基因,进而纯化并分析其反应原性.【方法】根据GenBank已发表的ORFV(GQ328006)的B2L基因序列设计一对特异引物,以提取阳性临床样品的总DNA为模板,通过PCR方法获得ORFV的B2L基因,将该基因片段连接至原核表达载体pET-30a(+)上,获得重组质粒pET-30a(+)-B2L.将此重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,挑取单克隆进行扩大培养,经IPTG诱导获得重组融合蛋白.用SDS-PAGE和Western-blotting对表达的目的蛋白进行分析.【结果】成功获得重组质粒pET-30a(+)-B2L,读码框正确.获得了43ku的表达产物,与预期目的蛋白大小相符;纯化后的目的蛋白能与ORFV阳性血清发生特异反应.【结论】成功对ORFV-B2L蛋白进行了原核表达,且纯化后蛋白具有良好的反应原性. 相似文献
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克隆牛布鲁氏菌的甲酰基转移酶基因（Wbkc）,在大肠杆菌中表达/纯化,并对甲酰基转移酶的抗原性进行分析。以牛布鲁氏菌的染色体DNA为模板,扩增Wbkc基因,双酶切后克隆至pET-28a上,在大肠杆菌BL21中诱导表达,His Trap FF层析柱纯化,Western blot鉴定甲酰基转移酶的抗原性。提取的重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析确定目的基因成功插入到了克隆载体中。SDS-PAGE分析证明,表达产物为相对分子质量29 000的融合蛋白。Western blot结果表明,表达的蛋白具有特异的免疫反应原性。 相似文献
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为了分离出兰州地区鸡群新城疫病毒(NDV,Newcastle disease virus)并将M蛋白进行原核表达。通过鸡胚尿囊腔接种培养分离得到的兰州地区NDV,采用血凝及血凝抑制实验和Western bolt对病毒进行鉴定。利用分子克隆方法将NDV M蛋白进行原核表达,用Western blot技术分析其反应原性。根据NCBI发表的NDV M基因构建进化树。结果表明,成功分离的NDV悬液经RT-PCR技术扩增出M基因片段,重组菌p ET-M经SDS-PAGE分析,在约42 k Da处有一明显的蛋白条带,Western blot技术证明其具有良好的反应原性。M基因进化树分析,分离毒株与La-Sota具有极高同源性。本研究成功分离出兰州地区NDV并将M蛋白进行原核表达,同时确定分离毒株与La-Sota毒株的同源性极高。为后续针对兰州地区新城疫流行病学调查和综合防控技术提供实验依据。 相似文献
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对鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白FliC的基因进行克隆、鉴定和原核表达,为鞭毛蛋白佐剂作用的研究奠定基础。以鼠伤寒沙门氏菌8014菌株基因组DNA为模板,PCR扩增Flic基因,产物与T载体连接,经测序鉴定正确后与表达载体pQE30(+)连接构建重组表达质粒Flic-pQE30,将此重组质粒转化入表达宿主E.coli XL1-Blue菌株内抽提质粒,酶切鉴定正确后对转化菌株以IPTG进行诱导后,表达产物经镍离子亲和层析柱纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。测序结果显示,FliC为完整的编码区基因1 485 bp,编码495个氨基酸残基,蛋白相对分子质量约为56 kDa。经SDS-PAGE分析表明,以37℃、1 mM的IPTG诱导5 h,表达效果最好,诱导产物是与理论值相符的56 kDa的融合蛋白。经western-blotting检测,表达的重组蛋白FliC可与小鼠抗鼠伤寒沙门氏菌全菌体多抗血清反应得到清晰的目的条带,表明表达的重组蛋白具有良好的反应原性。成功进行了鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白Flic基因的克隆表达,为进一步研究其免疫佐剂作用奠定了基础。 相似文献
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针对大陆农业发展存在的不足有必要建立产销通路 ,并提及物流在流通环节的重要性。最后就大陆各地的招商引资提出了意见 相似文献
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秸秆切碎灭茬机的设计与试验 总被引：7，自引：0，他引：7
针对双轴击切式破碎秸秆和根茬所存在的问题，本文提出单轴压切原理和非等长刀切碎模型，并对秸杆切碎灭茬机的关键参数进行了优化设计。该机田间试验表明切碎率达91．4％，根茬破碎率达86．5％。该机的应用必将促进一年两熟平作旱区保护性耕作技术的发展。 相似文献
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《机械原理》和《机械设计》两门课程的实验教学在培养学生的综合设计、创新设计能力等方面,有其他课程不可替代的重要作用,针对两门课程传统实验教学中存在的问题,提出了以独立设课为中心的实验教学改革和实践方案,取得了显著的效果。 相似文献
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副猪嗜血杆菌分离鉴定与PCR检测方法的建立及应用 总被引：10，自引：0，他引：10
从养猪场送检的猪肺病料中分离到3株疑似副猪嗜血杆菌(HPS)可疑菌株。经形态镜检、染色特性、生化和部分生物学特性试验,初步鉴定为HPS。在细菌学鉴定基础上,设计合成3对引物,分别以3株分离菌株的DNA为模板进行PCR扩增,结果均扩增出822 bp8、24 bp和1.9 kb的预期特异性条带。以HPS GD株作为参考阳性菌株,以P1、P2为引物,设计优化PCR反应程序,建立HPS PCR检测方法,并应用于临床病料检测。结果表明,所建立的HPS PCR检测方法特异与敏感性高、适用性强,可应用于HPS感染的诊断和检测。 相似文献
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灌水和过量施钾对烤烟养分含量及烟叶产量品质的影响 总被引：13，自引：1，他引：13
采用田间试验研究了灌水和过量施钾对烤烟（Nicotiana tabacum L.)养分含量和产量品质的影响。结果表明，在烤烟N：K2O用量比达到1：3的基础上随钾用量增加，烟株体内营养元素含量、烟叶产量和化学成分均没显著差异，灌水可以显著提高烟叶产量和上等烟比例，但灌水与钾用量互作对烤后烟叶养分含量和化学成分的影响不显著。 相似文献
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苦荞的成分功能研究与开发应用 总被引：46，自引：0，他引：46
苦荞具有丰富的营养价值 ,它既能食用 ,又能防病、治病 ,为许多其它主要食物所不及。我国有丰富的苦荞资源 ,对苦荞的深入研究和开发应用有利于改善和提高人们的食物结构 ,同时也有助于促进贫困山区的脱贫致富。本文就苦荞的营养价值、药用价值和开发应用等方面的问题进行了阐述 相似文献
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为了提高厌氧水解效率,采用双层平板法筛选出一株耐低温兼性厌氧蛋白酶产生菌192.经形态、生理生化和16S rDNA序列分析鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus),对其产酶条件进行了初步研究.结果表明,该茵的最适生长温度为30℃,生长8～12h达对数期,初始pH 7.5时酶活力最高.蛋白酶最适反应温度为45℃、pH 7.0,酶活力最高达39.3 U/mL.该酶在50℃以下,pH 6.0～9.0性能稳定.在60℃以上热稳定性很差,70℃保存lh酶活力全部丧失. 相似文献
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[目的]仔猪在14日龄接种蓝耳病毒疫苗,25日龄接种猪瘟疫苗,检测接种蓝耳病疫苗和猪瘟疫苗后的免疫合格率。[方法]采用猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒检测抗体表达量。[结果]猪蓝耳病疫苗免疫3 d后,6.7%免疫个体为抗体阳性,免疫7 d后,26.7%免疫个体为抗体阳性,免疫14 d后,85%免疫个体为抗体阳性,免疫后30 d 100%免疫个体为抗体阳性;猪瘟疫苗免疫3 d后,13%免疫个体为抗体阳性,免疫7 d后,40%免疫个体为抗体阳性,免疫14 d后,58.3%免疫个体为抗体阳性,免疫30 d后,83.3%免疫个体为抗体阳性。[结论]仔猪在蓝耳病疫苗免疫3 d后抗体效价最低,30 d后免疫效果很好,接种猪瘟疫苗3 d后抗体效价最低,仔猪不足以抵抗病毒侵袭,虽然蓝耳病疫苗和猪瘟疫苗接种后30 d,抗体水平都达到了农业部规定的70%的标准,但是猪瘟疫苗免疫效果不能达到100%理想效果。 相似文献