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根据GenBank已发表的鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）基因组（登录号：JX273153）保守基因序列,设计了1对特异性引物及TaqMan探针,以DTMUV重组质粒为阳性标准品模板,建立了快速、准确检测DTMUV的荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法特异性好,仅能在DTMUV样本中检出荧光信号,与其他病原不发生交叉反应;敏感性高,最低检测限可达25 copies/μL;不同梯度定量模板的拷贝数的对数值与CT值之间的线性关系表达式为Ct=–3.323×Lg（conc）+43.70,相关系数R2＝0.997,扩增效率E＝100%,DNA在2.5×101～2.5×107个拷贝数内检测曲线有良好的线性关系。对来源于江苏省和安徽省的29份疑似鸭坦布苏病毒感染的病鸭组织进行荧光定量RT-PCR检测,结果有27份呈现阳性,阳性检出率为93.10%,比常规RT-PCR的敏感性高。研究结果表明,该方法快速、灵敏、特异、重复性好且能实时定量检测,可用于DTMUV的临床检测和分子流行病学调查。 相似文献
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为建立一种快速的鸭坦布苏病毒病原检测方法,本研究根据GenBank上登录的鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)基因组序列,设计1对引物,建立了检测DTMUV的RT-PCR诊断方法。该方法对Ⅰ型鸭肝炎病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、鸭肠炎病毒等常见鸭病的扩增结果均为阴性,检测的敏感性达1 ng RNA。该RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可以准确快速检测出极低含量的DTMUV,将为DTMUV的病原检测及分子流行病学调查等提供一种快速、灵敏、特异、准确的分子生物学检测方法。 相似文献
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《中国家禽》2017,(20)
研究旨在建立一种适用于鸭坦布苏病毒检测的荧光定量Taq Man RT-PCR技术。以JXSP株RNA为模板,建立检测鸭坦布苏病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。制备含有上述目的片段的RNA作为标准品,10倍比稀释后建立标准曲线,测定敏感性。同时采用标准品对该方法的批内和批间重复性进行检测,并与本实验室所保存的多种病毒进行特异性检测。结果:建立的荧光定量Taq Man RT-PCR方法能在鸭坦布苏病毒JXSP株RNA样本中检出荧光信号。最低检出量为2.06×10~1拷贝/反应;线性范围达9个数量级。该方法重复性良好,批内变异系数不足0.4%;批间变异系数不足2.2%。该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,经体外感染细胞培养物及临床样品检测证实,该方法可实时反映病毒液中的病毒含量,可在获得样品后3 h以内得到检测结果,可用于临床样品中鸭坦布苏病毒的快速检测。 相似文献
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《中国家禽》2017,(19)
为了开发鸭坦布苏病毒间接ELISA抗体检测试剂盒,研究利用灭活纯化的鸭坦布苏病毒(DTMUV)FX2010株作为包被抗原,由瑞普(保定)生物药业有限公司连续制备了5批次鸭坦布苏病毒间接ELISA抗体检测试剂盒中试产品。该试剂盒对禽流感病毒、鸭瘟病毒、鸭细小病毒、Ⅰ型鸭肝炎病毒、鸭呼肠孤病毒阳性血清和5份SPF阴性质控血清进行的检测均无交叉反应,表明具有较好的特异性。批内和批间重复性试验的变异系数为1.5%~4.2%和2.2%~5.3%,表明产品具有很好的稳定性。应用该试剂盒及中和试验对300份疑似DTMUV阳性血清样品进行检测,结果显示:二者阳性样品符合率为90.12%,阴性样品符合率为93.6%,总符合率为92.7%。研究结果表明,该试剂盒具有操作简便、敏感性高和特异性强的特点,可以为鸭坦布苏病毒病的快速诊断及其流行病学调查提供有力的工具。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2014,(23)
为了研究一种可同时检测鸭坦布苏病毒与鸭圆环病毒的二重PCR方法,试验采用DNASTAR及Primer Premier 5.0软件,针对Gen Bank中坦布苏病毒(DTMUV)E基因和鸭圆环病毒(Du CV)REP基因的保守序列,设计合成了2对引物,通过优化反应体系条件及特异性、敏感性评价,建立了鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒的二重RT-PCR方法。结果表明:该方法对鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒的检测敏感性达到100 fg;使用该方法对新城疫病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、番鸭呼肠孤病毒、H9亚型禽流感病毒和减蛋综合征病毒的检测结果全为阴性。说明建立的二重RT-PCR检测方法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒感染的快速鉴别诊断。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2021,(9)
为建立鉴别检测鸭坦布苏病毒(DTMUV)、新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)及番鸭呼肠孤病毒(MDRV)的方法,本研究分别针对DTMUV E基因与NDRV、MDRV S3基因,设计特异性引物和Taq Man探针,经优化反应条件,建立了同一体系中同时检测DTMUV、NDRV及MDRV的Taq Man荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法仅能扩增DTMUV、NDRV及MDRV,与禽呼肠孤病毒(ARV)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、鸭瘟病毒(DEV)等主要禽源病毒均无交叉反应,特异性强;对DTMUV、NDRV及MDRV质粒标准品的检测下限均为7.5×10~1拷贝/μL,敏感性高;组内与组间重复性试验变异系数均小于2.5%,重复性好。利用该方法与已报道的坦布苏病毒荧光定量RT-PCR方法及NDRV与MDRV双重RTPCR方法同时检测82份临床疑似患病鸭的肝脾组织样品,结果检出阳性样品22份,其中,DTMUV阳性检出率为10.98%(9/82),NDRV阳性检出率为2.44%(2/82),MDRV阳性检出率为13.41%(11/82),检出阴性样品60份。与参考方法的检测结果一致,三者的符合率达100%。本研究建立的方法为临床DTMUV、NDRV及MDRV鉴别检测和流行病学调查提供了特异、敏感、高效的技术支撑。 相似文献
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为了解山东地区鸭坦布苏病毒(DTMUV)的流行及其分子的遗传变异情况,本研究自山东的菏泽、泰安、济宁、枣庄等9个地区搜集临床样品,利用RT-PCR、荧光定量PCR等方法进行检测,并进行分离株E基因及全基因的遗传进化分析;同时,采用阻断ELISA方法检测不同地区未免疫DTMUV病疫苗的不同品种鸭群的血清样品。结果显示,临床样品中DTMUV检出率为13.3%(36/270)。对分离株E基因的序列分析表明,本研究分离的DTMUV与已发布的禽坦布苏病毒基因的同源性在96.5%以上。两株分离株的全基因序列分析表明,部分氨基酸位点发生了变异。血清抗体检测结果显示,不同地区及品种的DTMUV感染情况差别较大,肉鸭在德州和滨州未检测到阳性,而在泰安的阳性率为42.2%,后备种鸭和蛋鸭在各地区的阳性率高低不一;从鸭的品种来分析,蛋鸭是感染最严重的鸭群,阳性率为55.6%。结果表明,坦布苏病毒对山东水禽养殖仍有一定的危害,目前山东地区流行的DTMUV与之前分离的禽坦布苏病毒同源性较高,未出现明显的分子变异。 相似文献
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《云南畜牧兽医》2020,(1)
宜良县某鸭场产蛋期樱桃谷母鸭群出现产蛋异常,对发病鸭群进行了病理剖检以及细菌分离培养、主要疫病血清学抗体的检测和病原核酸的RT-PCR检测与分析。结果显示所检样品无大肠杆菌、沙门氏菌等细菌感染;ND、H5、H7、H9抗体水平没有异常变化,A型流感病毒、新城疫病毒RT-PCR检测结果均呈阴性;鸭坦布苏病毒RT-PCR检测结果阳性,样品PCR产物测序分析显示该核酸序列来源于DTMUV基因组,表明该样品感染了坦布苏病毒。结合临床症状、剖检变化、实验室检测结果以及针对感染鸭坦布苏病毒的防治措施与效果观察,诊断该鸭场产蛋下降的异常情况是由鸭坦布苏病毒感染所引起的。 相似文献
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血清3型鸭甲型肝炎病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用 总被引：1，自引：1，他引：0
通过对GenBank公布的鸭甲型肝炎病毒全序列比对,在3型鸭甲肝炎病毒（DHVA-3）5’非编码区的保守区,设计了一对检测引物和一条特异性TaqMan探针,以构建的阳性重组质粒经体外转录合成的RNA作为标准品绘制标准曲线,建立了一种快速检测DHAV-3的实时荧光定量RT—PCR方法。该方法能特异性地检测出DHAV-3,而与血清1型鸭肝炎病毒（DHAV-1）、鸭瘟病毒、新城疫病毒、禽流感病毒（H9）、呼肠孤病毒、传染性支气管炎病毒无交叉反应。在1．8×10^3～1．8×10^8copies／μL的检测范围内标准曲线线性关系较好,R2为0．992。敏感性试验表明,最低检测限为36拷贝数RNA。用该方法和胚半数致死量法对尿囊液中病毒含量进行检测,表明二种方法检测结果呈正相关。本研究所建立的检测方法特异性好,灵敏度高,且操作方便,可为该病毒的快速诊断和流行病学调查提供技术手段。 相似文献
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为实现鸭坦布苏病毒（duck tembusu virus,DTMUV）的快速检测,本研究根据GenBank中公布的DTMUV E蛋白基因的高度保守序列设计了1套引物,通过优化反应体系各组分的浓度、反应时间和温度,建立了一种灵敏、便捷的RT-LAMP扩增方法。结果显示,在最佳条件下甜菜碱对反应体系影响不明显;该方法灵敏度是常规RT-PCR的100倍;只能特异性扩增坦布苏病毒,对于其他常见的禽源病毒无特异性扩增;检测结果可直接通过肉眼观察来判断;对临床74份疑似病料,可检出65份。本试验建立的方法灵敏性高、特异性强,可用于鸭坦布苏病毒病的临床诊断和流行病学调查。 相似文献
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WU Zhi XIA Wen-long CAI Shu-dong GUO Chang-ming YUAN Wei-feng WANG Yong-juan 《中国畜牧兽医》2017,44(11):3334-3339
To realize the rapid detection of duck tembusu virus (DTMUV), a set of specific primers was designed according to the highly conserved sequence of DTMUV E protein gene published in GenBank. A sensitive and convenient RT-LAMP amplification method was established by optimizing the concentrations of each component, reaction time and temperature in the reaction system. The results showed that the influence of betaine on the reaction system was not obvious under the optimal conditions. This method was 100 times more sensitive than the conventional RT-PCR. The RT-LAMP method specifically amplified tembusu virus but not other common avian viruses. The results could be differentiated by naked eyes. 74 clinic suspicious samples were tested and 65 of them were positive. These results suggested that the RT-LAMP assay could be used as a method for the diagnosis and detection of clinical cases, and molecular epidemiological investigation of duck tembusu virus disease. 相似文献
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鸭黄病毒感染逆转录半套式PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank发布的黄病毒Bagaza毒株的NS3基因的保守序列设计了3条引物,建立了一种适用于鸭黄病毒的半套式PCR快速检测方法。采用该方法对鸭黄病毒山东分离株进行检测,结果半套式PCR对2株分离株均能扩增出277bp的特异性条带,而对鸭瘟病毒、禽流感病毒（H9亚型）、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒的扩增结果均为阴性;经检测该方法第1次扩增的敏感性为1×105拷贝/μL,第2次扩增的敏感性为1×102拷贝/μL,第2次扩增的敏感性比第1次高103倍;该方法对山东省各地采集的24份疑似病料可检出22份阳性。表明本试验所建立的套式PCR方法可用于鸭黄病毒感染的临床诊断和流行病学调查。 相似文献
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The study was conducted to establish the duplex Real-time PCR assay for detecting both duck tembusu virus (DTMUV) and duck plague virus (DPV). According to the sequences of DTMUV E gene and DPV UL6 gene in GenBank, two sets of specific oligonucleotide primers for DTMUV and DPV along with two TaqMan probes were designed. The duplex Real-time PCR assay was developed through optimization of reaction conditions and validation of specificity, sensitivity and repetitiveness of the method. The sensitivity of the assay were both 100 template copies for DTMUV and DPV. There was no specific bands of the same sizes were amplified from other duck pathogens, such as duck Newcastle disease virus, duck hepatitis virus, muscovy duck parvovirus, duck circovirus, H9 subtype avian influenza virus, egg drop syndrome virus. This duplex Real-time RT-PCR assay is a sensitive, quick, specific and quantitative test for detection of DTMUV and DPV, and will be useful for the control of these viruses in ducks. 相似文献
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根据GenBank中鸭Ⅰ型肝炎病毒的基因序列,设计合成一对引物和一条Taq-Man探针。进行优化后,建立了能够检测鸭Ⅰ型肝炎病毒的荧光定量RT-PCR方法。该方法敏感性好,检测敏感性达到20个模板拷贝数,比常规PCR灵敏度高100倍;该方法特异性强,对番鸭细小病毒、鸭圆环病毒和鹅细小病毒等6种病原体的检测全为阴性。对广西地区鸭群收集的118份病料进行检测,结果阳性率为1.69%。结果提示:在广西地区的鸭群中,存在鸭Ⅰ型肝炎病毒的感染,建立的荧光定量RT-PCR方法可用于鸭Ⅰ型肝炎病毒的临床快速检测。 相似文献
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旨在建立一种针对鸭甲肝病毒1型（DHAV-1）和鸭甲肝病毒3型（DHAV-3）的高效快速、高灵敏度和高特异性的双重TaqMan实时荧光定量PCR （q-PCR）检测方法并应用于临床疑似样品检测。根据DHAV-1和DHAV-3的VP1基因保守区域,分别设计合成了2对特异性引物和探针,在此基础上建立并优化了双重TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果显示：优化后标准曲线的相关系数（R2）均在0.999以上,扩增效率（E）在105%~110%,其组内变异系数（i-CV）与组间变异系数（c-CV）均在0.77%以下。运用双重q-PCR方法对不同稀释度的混合质粒与病毒核酸进行检测,结果表明,建立的双重TaqMan q-PCR特异性高;同时检测DHAV-1和DHAV-3的灵敏度均可达10个拷贝,分别是常规PCR方法的1 000倍和100倍。对40份来自苏中、苏北地区的疑似鸭肝炎病毒感染的鸭组织病料进行检测,结果表明,q-PCR方法检出36份阳性病料,阳性率为90%;而常规PCR方法未能检出高Ct值的样品,阳性率为72.5%（29份阳性病料）。建立的双重TaqManq-PCR检测方法为DHAV-1与DHAV-3的临床样品检测提供了高效、灵敏、特异的工具,推动了临床分子流行病学调查及病毒定量分析等研究。 相似文献
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为了建立检测(番鸭)呼肠孤病毒(DRV)感染的方法,本研究根据DRV的σNS基因核苷酸序列设计引物及TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了该病毒的TaqMan探针实时荧光RT-PCR检测方法.用已知浓度的重组质粒为标准品,构建的标准曲线的相关系数达到99%.试验表明,该方法的重复性、稳定性、特异性良好,且灵敏度高,可以检测到1.0×10~2拷贝/μL的标准品,比普通PCR至少高100倍.该检测方法对DRV人工感染番鸭肝脏组织检出率达到100%.本实验所建立的TaqMan探针荧光RT-PCR为的快速检测以及进行分子流行病学的调查提供了新的技术手段. 相似文献
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本研究建立了一种快速的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H52株定量检测方法,为进一步研究疫苗的效价检测和质量监控新方法奠定基础。针对IBV核蛋白(N)基因,设计特异的H52株荧光定量PCR检测引物和TaqMan-MGB探针,优化反应体系和条件后进行特异性、敏感性、重复性试验,探讨荧光定量RT-PCR与EID50方法测定病毒含量的相关性,并通过体外转录技术对病毒基因拷贝数进行定量分析。该方法特异性强,与其他禽源病毒均无交叉反应;该方法可检测到5.60×101拷贝/μL的病毒核酸,与常规PCR相比,敏感性高10倍;重复性试验的变异系数为0.9%~3.2%;与EID50检测结果的相关系数r＝0.934,两种方法在检测H52株病毒效价上具有很好的相关性。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法,适合于对鸡传染性支气管炎病毒H52株病毒含量的快速定量检测。 相似文献