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1.
已知感染猪群的冠状病毒有猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV);本研究拟建立针对这6种病毒的通用荧光定量PCR检测方法。依据NCBI公布的这6种猪冠状病毒序列，利用MEGA软件进行全基因序列比对，通过分析在ORF1b中找到1段长为196 bp的保守序列，设计兼并引物，建立了用于检测猪冠状病毒的通用荧光定量PCR检测方法；结果显示，该检测方法能扩增出6种猪冠状病毒，对PDCoV、PRCV、PHEV、SADS-CoV、TGEV的灵敏性均可达到101拷贝/μL,对PEDV的灵敏性可达到100拷贝/μL;与CSFV、PRRSV、PPV、PCV、PRV无交叉反应，特异性良好；组内和组间变异系数均小于2.2%,重复性良好。利用建立的检测方法对62份病料进行检测，检测出27份样品呈现猪冠状病毒阳性，而利用普通RT-PCR方法共检测出24份阳性样品。选择2份猪冠状病毒阳性样品进行克隆测序，在NCB... 相似文献
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为鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)这4种猪主要腹泻病毒，本研究分别针对PEDV M基因、TGEV M基因、PoRV NSP5基因、PDCoV M基因设计特异性引物和探针，经过方阵法优化恒温隔绝式荧光RT-PCR(iiRT-PCR)反应条件，建立了检测这4种猪腹泻病毒iiRT-PCR方法。用建立的iiRT-PCR方法分别检测PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本脑炎病毒(JEV),并对iiRT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示该方法特异性强，对PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的检测下限分别为102、102、103、103 TCID50/mL,并具有良好的组内和组间重复性；而荧光定量PCR方法的检测下限分别为101、102、102、102<... 相似文献
3.
为建立快速、灵敏且特异的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒（swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV）检测方法,本试验扩增SADS-CoV N基因保守区域将其克隆至pMD18-T载体。所构建的重组质粒pMD18-T-SADS-qN作为阳性质粒标准品,以其为模板建立一种SYBR Green荧光定量PCR检测方法。结果显示,所建立方法在3.31×101~3.31×107拷贝·μL-1模板量时,呈良好的线性关系,相关系数（R2）为0.997,斜率为-3.318。该方法特异性检测SADS-CoV;而猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）检测结果均为阴性。所构建的标准品检测灵敏度下限可以达到3.31×101拷贝·μL-1,组内和组间变异系数均小于1%,表明其具有良好的灵敏性和重复性。用该方法检测SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2细胞后不同时间点和不同接毒剂量的复制情况,结果显示,SADS-CoV感染细胞后2 h病毒含量较低,在12~36 h病毒含量迅速增长,36 h后增长速度减缓且病毒含量维持在较高水平。分别用0、0.1、1 MOI SADS-CoV感染细胞结果显示病毒的mRAN转录水平呈现剂量依赖性增加,当MOI为1时,IPI-2I和IPEC-J2细胞病毒含量分别为106.7、105.3拷贝·mL-1。进一步利用所建立的方法对经口服攻毒SADS-CoV仔猪的临床样本进行检测,结果发现病毒在空肠回肠含量较高,表明病毒主要定殖于空肠和回肠。综上表明,本研究建立SYBR Green荧光定量PCR检测方法能灵敏特异地检测SADS-CoV,为SADS-CoV的诊断和病毒相关基础研究提供可靠的检测手段。 相似文献
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为建立检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法，本试验参考GenBank中登录的猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)M基因、猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus, PSV)VP1基因、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)N基因和猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)N基因的序列，分别设计相应的引物，构建4种病毒的阳性质粒。以阳性质粒为标准品，通过优化反应条件和反应程序，建立了检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法，并确定了该检测方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示，该方法具有较高的灵敏性，对PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的最低检测量分别为1.37×102,1.44×102,1.51×102和1.56×102拷贝/μL。而扩增猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)、猪瘟病... 相似文献
5.
采用逆转录-重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)检测系统，建立一种快速、高灵敏度和高特异性的禽流感病毒(AIV)H5亚型核酸检测新方法。通过分析342条禽流感病毒H5亚型的HA基因序列，选取保守性区域设计具有强特异性的CRISPR RNA(crRNA)序列以及RT-RAA引物，并对检测体系中的主要成分LwaCas13a蛋白、crRNA、TaqMan探针、T7 RNA Polymerase、NTP Buffer Mix含量进行优化，建立了基于RT-RAA的AIV H5亚型核酸CRISPR-Cas13a检测方法。取105～1 copies·μL-1含有目的基因的质粒标准品和其他亚型禽流感病毒以及其他禽病病毒分别验证和评价该方法的灵敏性和特异性。结果表明，本文设计的RT-RAA引物与crRNA特异且灵敏，其最佳反应体系中主要成分用量分别为LwaCas13a蛋白(60μg·mL-1)2.0μL、crRNA(100μmol·L-1)3.2μL、TaqMan... 相似文献
6.
为实现对猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的快速鉴别诊断,根据PEDV的N基因和TGEV的S基因序列设计引物,并以猪β-肌动蛋白(ACTB)作为内参对照,建立了PEDV和TGEV的TaqMan探针双重荧光定量PCR检测方法。结果显示：该方法对PEDV、TGEV和ACTB的检测灵敏度分别为1、10和10 copies/μL;PEDV和TGEV敏感度为100.02 TCID50和100.05 TCID50,高于常规RT-PCR,批内和批间变异系数均小于1%。与猪德尔塔冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒、猪轮状病毒、乙型脑炎病毒、塞内卡谷病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、脑心肌炎病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型均无交叉反应。采集124份临床病料样品进行检测,PEDV阳性率为42.74%,TGEV阳性率为8.87%,检测结果与该病毒单一荧光RT-PCR方法的检测结果均一致,证明该方法具有较高特异性和敏感性,可用于PEDV和TGEV临床病料检测。 相似文献
7.
为实现对猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)、猪传染性胃肠炎(porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、猪轮状病毒(porcine rotavirus, PoRV)和猪流性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的同时鉴别检测,根据PDCoV M基因、TGEV S基因、PoRV VP6基因和TGEV N基因保守区域序列合成特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,成功建立了一种可同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的实时荧光RT-PCR方法。结果显示,所建立的四重实时荧光RT-PCR方法仅对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV出现阳性扩增,与PRV、PPV、PRRSV、CSFV、PCV2等猪常见病原无交叉反应;对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的最低检出限分别为1.17×103,1.13×103,1.31×102和1.18×102<... 相似文献
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为建立一种灵敏、特异且高效的检测盖他病毒(GETV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法，本研究根据GETV的nsP3基因设计特异性引物及探针，以GETV (SC483株) cDNA作为模板，扩增目的基因并克隆至p ET-29a载体中，构建重组质粒标准品p ET29a-nsP3并经PCR和测序鉴定。基于该质粒标准品，采用方阵法优化引物、探针浓度以及退火温度，初步建立了一种基于GETV nsP3基因的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，并绘制标准曲线。以GETV (SC483株、SC266株)、辛德毕斯病毒(SINV)、猪流感病毒(H3N2、SIV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)等病毒的基因组RNA反转录为cDNA作为模板，利用本实验建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法检测，结果显示，仅GETV为阳性，SINV、SIV、TGEV、PEDV、PRRSV均为阴性，表明该方法特异性较强；分别以10倍倍比稀释(3.07×10-1拷贝/μL～3.07×108拷贝/μL... 相似文献
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PEDV、TGEV和PRoV多重RT-PCR检测方法的建立及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）及猪轮状病毒（PRoV）的快速鉴别检测方法,本试验针对PEDV、TGEV、PRoV的基因组序列设计3对特异性引物PEDV-N、TGEV-M和PRoV-VP6,分别扩增PEDV N基因、TGEV M基因和PRoV VP6基因。经优化反应条件,成功建立了能同时检测并区分PEDV、TGEV、PRoV的多重RT-PCR方法。该方法可特异扩增PEDV、TGEV、PRoV相应的基因片段,而与猪瘟病毒（CSFV）、猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒2型（PCV2）均无交叉反应;对PEDV、TGEV、PRoV基因重组质粒标准品的检出限分别为1.41×103、1.41×102和1.41×103拷贝/μL;在相同条件下重复试验可获得一致的结果。应用该方法对临床采集的190份腹泻病料进行检测,结果PEDV阳性42份,阳性率22.11%;TGEV阳性58份,阳性率30.53%;PRoV阳性34份,阳性率17.89%,且存在不同病毒混合感染的现象。结果表明,所建立的多重RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的优点,可用于PEDV、TGEV和PRoV的临床检测和流行病学调查。 相似文献
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为建立禽偏肺病毒(aMPV)微滴式数字PCR (ddPCR)检测方法，本研究以aMPV F基因为靶基因，根据其保守区域设计特异性引物和探针，通过各反应条件的优化，初步建立检测aMPV的dd PCR方法。反应条件优化结果显示，最佳引物终浓度1μmol/μL，探针终浓度0.5μmol/μL，退火温度56℃。绘制的标准曲线显示，重组质粒标准品稀释倍数的对数与相应质粒检出拷贝数的对数呈良好的线性关系(R2=0.999 8)。采用该方法同时检测aMPV、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒和禽腺病毒，结果显示，仅aMPV检测为阳性，其他病原均为阴性。特异性较强。将p MD18-aMPV重组质粒标准品10倍倍比稀释(105～109,4.3×103拷贝/μL～4.3×10-1拷贝/μL)后作为模板，采用该方法检测，结果显示该方法对重组质粒标准品的检测限为4.3拷贝/μL，比荧光定量PCR (qPCR)检测限(43拷贝/μL)敏感。对3个稀释度质粒标准品... 相似文献
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为建立鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)的方法,本研究分别针对PEDVN基因、TGEVM基因、PDCoVM基因和PRoVVP6基因设计特异性引物和TaqMan探针,经过优化反应条件,建立了同时检测4种病毒的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法仅特异性扩增PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,与猪其它主要病毒无交叉反应,特异性较强;对PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的质粒标准品的最低检出限分别为2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^1拷贝/μL、2.06×10^3拷贝/μL,具有较高敏感性;组内与组间变异系数均小于1.1%,具有良好的重复性。应用该方法和普通多重RT-PCR检测临床采集的243份腹泻病料样品,两者的符合率为96.71%。本研究建立的方法为临床PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的鉴别检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感、高效的技术手段。 相似文献
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为建立一种可现场快速准确检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)的方法，本研究结合重组酶介导扩增(RAA)和侧向流试纸条(LFD)技术，根据SVCV L基因保守区域设计引物及探针，通过优化反应时间和温度等条件，初步建立了可用于SVCV现场可视化检测的RT-RAA-LFD方法。优化后的检测方法在35℃水浴锅中恒温反应15 min即可实现对SVCV目的基因片段的有效扩增。结果显示，该方法可以特异性的检测SVCV，并且不与病毒性出血败血症病毒、传染性鲑鱼贫血症病毒、病毒性神经坏死病毒等其他常见鱼类病毒发生交叉反应；对SVCV重组质粒标准品的检测限为2.42×102拷贝/μL，并具有较好的稳定性和重复性；采用该方法和病毒分离、套式RT-PCR、荧光定量RT-PCR、荧光定量RT-RAA共5种方法同时对45份临床样品检测，其中病毒分离、套式RT-PCR和荧光定量RT-PCR均检测到29份阳性样品，荧光定量RT-RAA和本研究建立的方法均检测到28份阳性样品，本研究与前3种方法的阳性符合率为97.8%，与荧光定量RT-RAA的阳性符合率为100%。上述结果表明，本研究建立的SVCV ... 相似文献
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将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification, RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a)技术相结合，即RAA-Cas13a,建议建立高效、灵敏、特异的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)检测方法。针对PEDV N基因保守区设计RAA特异性引物和CRISPR RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸，并进行CRISPR-Cas13a荧光检测，以RT-qPCR为对照方法，评价该方法的灵敏度、特异性及与RT-qPCR法的一致性。结果表明，该方法最低可检测至101 copies·μL-1,且与猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒及猪伪狂犬病病毒等常见猪源病原核酸检测无交叉反应。采用RAA-Cas13a检测40份临床样本与RT-qPCR方法阳性符合率为100%,阴性符合率为84.6%,总符合率为95%,Kappa值为0.881。本研究建立的RAA-Cas13... 相似文献
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采用PCR方法克隆了猪圆环病毒2型 (porcine circovirus 2,PCV2) 衣壳蛋白（capsid protein,CAP）基因,构建了重组质粒p-18T-CAP,并将其作为标准阳性模板。参照GenBank收录的PCV2 ORF2基因设计合成1对特异性的引物和与该引物相匹配的特异探针,通过对反应条件进行优化,以定量的10倍系列稀释的质粒p-18T-CAP为标准品进行TaqMan荧光定量PCR扩增,建立了一种检测PCV2的TaqMan荧光定量PCR方法。试验结果显示,该方法与猪圆环病毒 1 型、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒等均无交叉反应;该方法最低可检测到4.53×102拷贝/μL,比PCR检测方法高100倍;其标准曲线线性范围是102～109拷贝/μL,且具有良好的重复性。 相似文献
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本研究旨在建立一种特异、灵敏、快速的ASFV-G-ΔI177L实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法。针对ASFV I117L基因的保守区域设计特异性引物/探针对，通过优化反应条件和反应程序，从而提高检测方法的灵敏性，并验证检测方法的重复性和特异性。对170份临床样品进行了检测，并与OIE推荐的检测方法进行对比。结果表明，基于ASFV I117L基因所设计的特异性引物/探针对，能扩增2.2×101～2.2×1010copies·μL-1的pMD18-I177L标准质粒，建立的标准曲线R2可达0.995 7,最低检测模板浓度为2.2×101copies·μL-1;该方法扩增反应采用一步法，耗时35 min,批内、批间变异系数均<1.8%;针对ASFV I177L基因特异性扩增，但对其他5种常见猪病毒核酸样品及无酶水未见阳性扩增；用该方法对170份临床样品进行检测，本方法和OIE推荐的检测方法具有良好的一致性。本研究成功建立了一种特异、灵敏、快速AS... 相似文献
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为快速检测猪圆环病毒4型(PCV4),本研究根据PCV4的Cap基因片段保守区设计引物和探针,建立了PCV4重组酶介导核酸等温扩增荧光法(RAA),并应用该方法对40份猪组织样品进行检测。结果表明,该方法可在20 min内,42℃恒温条件下特异性检测出PCV4,以猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒核酸为模板进行反应的扩增结果均为阴性;最低检出限至7.42×101拷贝/μL,灵敏度较高。利用建立的RAA检测方法和常规PCR法分别对猪组织样本进行检测,均未检出,表明当前猪场流行率较低。综上所述,本研究建立的PCV4实时荧光RAA检测方法快速简便、特异性强、灵敏度较高,可应用于PCV4的临床筛查与流行病学研究。 相似文献
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旨在建立特异、敏感的实时荧光定量PCR（FQ-PCR）方法,用于非洲猪瘟病毒（ASFV）和猪瘟病毒（CSFV）野毒株的快速鉴别检测。针对ASFV的P72基因和CSFV野毒株的5'UTR非编码区序列的保守区域分别设计1对特异性引物和1条探针,经优化反应条件,建立一种基于TaqMan MGB探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和稳定性,对50份临床样品进行检测,并与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法进行比较分析。结果显示：建立的鉴别ASFV和CSFV野毒株二重FQ-PCR检测方法在100~106拷贝·μL-1模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和CSFV基因出现阳性扩增信号,但对猪瘟病毒疫苗株、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、副猪嗜血杆菌等病原对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在1.18%~2.08%,重复性良好;对ASFV和CSFV的最低检测模板浓度均为10拷贝·μL-1;利用建立的二重FQ-PCR方法对50份临床样品进行检测,检测结果与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法结果完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法,为ASFV和CSFV野毒株的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。 相似文献
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为了研究猪乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)在仓鼠肾细胞(BHK-21细胞)中的增殖情况，试验首先建立了实时荧光定量PCR方法，并检测该方法的敏感性、特异性和重复性，然后利用建立的实时荧光定量PCR方法和病毒半数组织感染量(TCID50)方法测定并比较猪JEV在BHK-21细胞中的增殖规律。结果表明：建立的猪JEV实时荧光定量PCR检测方法的扩增效率为99.3%,敏感性、特异性和重复性良好，检测敏感性可以达到1.0×101 copies/μL;TCID50方法测定的细胞悬液和细胞培养上清液中的病毒含量分别为1.0×105.44 TCID50/0.1 mL和1.0×104.86 TCID50/0.1 mL,实时荧光定量方法测定的病毒粒子数量分别为1.0×107.50 copies/μL和1.0×105.60 copies/μL,两种方法在细胞悬液中... 相似文献
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为建立鉴别检测鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)及鸭圆环病毒(DuCV)的方法，本研究分别针对GPV、MDPV NS基因与Du CV Rep基因，设计特异性引物和Taq Man探针，经优化反应条件，建立了同一体系中同时鉴别检测GPV、MDPV及Du CV的Taq Man荧光定量PCR方法。利用该方法检测GPV、MDPV、Du CV及禽流感病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒、减蛋综合征病毒、鸭坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒等主要水禽源病毒，结果显示，该方法仅能扩增出GPV、MDPV及Du CV，与其他主要水禽源病毒均无交叉反应，特异性强；利用该方法检测等体积混合后的GPV、MDPV及Du CV质粒标准品混合物，结果显示，该方法对3种质粒标准品的检测限均为7.5×101拷贝/μL，普通单一PCR对上述3种质粒标准品混合物的检测限均为7.5×103拷贝/μL，表明本研究建立方法的敏感性高于普通PCR；该方法组内与组间重复性试验的变异系数均小于2.0%，重复性好。利用该方法与MDPV和GPV双重荧光定量PCR方法及Du CV荧光定量PCR方法同时检测... 相似文献