共查询到20条相似文献，搜索用时 62 毫秒
1.
为制备抗分泌片多克隆抗体,采用分子筛凝胶层析、离子交换层析和硫酸铵盐析法从猪初乳中分离纯化分泌片和SIgA。SDS—PAGE鉴定表明,纯化的SIgA呈现分泌片、重链和轻链三条带,大小约为70ku;凝胶薄层扫描分析SIgA和分泌片纯度分别为90％和89％;琼脂扩散鉴定表明,SIgA和分泌片与抗分泌片单克隆抗体发生了特异反应。以纯化分泌片为抗原,制备抗分泌片多克隆抗体,琼脂扩散检测多抗的效价为1：32。高纯度分泌片的提取及高效价抗分泌片多抗的制备为粘膜负．疫研究奠定了物质基础。 相似文献
2.
SIgA是评价黏膜免疫的重要指标,分泌片(SC)是SIgA的特有成分,为了更方便的获得大量的SIgA的分泌片,本研究应用RT-PCR方法扩增出SC基因片段,将SC基因片段克隆到pGEX-4T-1原核表达载体上,经酶切和测序验证获得pGEX-4T-1-SC重组质粒;将获得的pGEX-4T-1-SC转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达重组蛋白rSC.重组蛋白rSC经鉴定和纯化后,按常规免疫程序制备多克隆抗体;利用Western blot对抗重组蛋白rSC的多克隆抗体进行鉴定.结果显示,该抗体能特异性识别猪初乳中的SIgA免疫球蛋白,而与猪初乳中的IgG不发生反应.因此,抗SC重组蛋白的多克隆抗体可以作为抗SIgA免疫球蛋白的特异性抗体,为进一步建立SIgA的检测方法及黏膜免疫的研究奠定基础. 相似文献
3.
为获得抗猪分泌型IgA(SIgA)的单克隆抗体(MAb),本研究以纯化的SIgA蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,通过间接ELISA方法筛选出1株稳定分泌抗SIgA SC片段的杂交瘤细胞株,命名为2F9。MAb亚类鉴定结果显示其亚类为IgG1/κ链。杂交瘤细胞培养上清液和腹水的效价分别为1∶200和1∶16 000。Western blot鉴定显示该MAb能够识别天然SIgA蛋白;IFA显示该MAb可以识别真核细胞表达的SIgA SC蛋白。抗猪SIgA SC片段的MAb制备,为建立一系列猪消化道病原的特异性SIgA诊断方法及研究黏膜免疫提供了重要工具,具有广阔的应用前景。 相似文献
4.
为建立快速检测禽类黏膜组织中SIgA含量的方法,本研究原核重组表达鸡SIgA重链片段蛋白,纯化后免疫BALB/c鼠.以鸡胆汁中分离纯化的SIgA作为检测抗原,常规单克隆技术筛选出1株能够稳定分泌抗鸡SIgA单克隆抗体(MAb)的IgG2a、κ型MAb.经ELISA和western blot分析,所获得的1株MAb亲和力高、特异性强;采用生物素标记纯化MAb腹水IgG为检测二抗,以禽流感-新城疫重组二联活载体疫苗免疫SPF鸡为模型,初步建立了新城疫病毒和H5亚型禽流感病毒特异的黏膜SIgA间接ELISA检测方法.本研究为开展特异性家禽黏膜免疫机制的研究提供了重要技术手段. 相似文献
5.
为了获得有效纯化抗体的方法,将杂交瘤细胞株（4C3）用细胞培养液扩大培养后制备腹水,所得腹水依次用50％和45％的饱和硫酸铵沉淀后再分别用亲和层析和反相层析进一步纯化抗体,并用SDS—PAGE和间接酶联免疫吸附试验分析其纯化抗体的纯度和活性。结果表明,亲和层析获得了较高纯度的抗体,并且抗体活性没有丧失,反相层析获得的抗体有较好的活性,但抗体中还有微量的杂蛋白。因此亲和层析是单抗纯化的较好途径,所获得的高纯度单抗将为O型口蹄疫病毒的基础研究和应用研究提供良好的物质基础。 相似文献
6.
以乳汁中SIgA特有的成分SC蛋白为研究对象，运用基因克隆、原核表达等方法，制备兔抗猪SC多克隆抗体，使用猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) S截短蛋白进行包被后，初步建立了一种可以检测母猪初乳中PEDV特异性SIgA抗体的ELISA方法。结果显示，PEDV特异性SIgA检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等特点。结果表明，该方法适用于检测临床中SIgA。该方法的成功建立为生产中评估仔猪从乳汁中获得SIgA的效率及制定更为完善的母猪免疫程序提供了有效的技术支持。 相似文献
7.
鸡和猪分泌型免疫球蛋白A结构蛋白的比较 总被引：11，自引：1，他引：11
通过SephadexG 2 0 0凝胶过滤和DEAE纤维素柱 ,分别从胆汁和初乳中提纯鸡和猪的分泌型免疫球蛋白A (SIgA)。SDS PAGE结果显示 ,鸡SIgA的轻链分子量约为 2 6 0 0 0～ 2 80 0 0 ,与鸡IgG的轻链分子量相似 ,而重链分子量约为 670 0 0～ 70 0 0 0 ,比鸡IgG的分子量要大。猪的SIgA与猪IgG的轻链和重链的分子量均相同。轻链的分子量约为 2 6 0 0 0～ 2 80 0 0 ;重链的分子量约为 53 0 0 0～ 570 0 0。猪SIgA中J链的分子量为 1 6 0 0 0～ 1 70 0 0。本实验证明鸡SIgA轻链的分子量与猪的SIgA的轻链相似 ,而鸡SIgA重链的分子量则高于猪的SIgA的重链 相似文献
8.
猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus, SADS-CoV)目前尚未有商品化诊断试剂盒，为填补行业空白，本研究制备了抗SADS-CoV核衣壳(N)蛋白单克隆抗体并对其序列进行了分析。利用原核表达系统表达SADS-CoV N蛋白并进行纯化，纯化的N蛋白作为免疫源免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合、筛选及亚克隆，获得5株能够稳定分泌抗SADS-CoV N蛋白的杂交瘤细胞株，将其命名为1C10、4B10、6G1、6F3和6E8;此外，利用套式PCR扩增技术获得了抗体可变区基因序列。间接免疫荧光试验(IFA)结果表明，5株单抗特异性识别Huh7细胞感染的SADS-CoV。ELISA结果表明，5株单抗与纯化的SADS-CoV N蛋白具有良好的反应性，但是，与SADS-CoV反应性分析发现，只有6E8的反应性较好，其余四株均不反应。Western blot结果表明，5株单抗均能特异性识别纯化的以及SADS-CoV感染表达的N蛋白。亚类分型鉴定结果表明，1C10、4B10、6G1和6F3重链为IgG1型，6E8为IgG2a型，它们... 相似文献
9.
为了探究重链抗体在骆驼免疫保护中的生物学作用,本研究利用Protein G和Protein A亲和层析纯化新疆双峰驼血清中总IgG和重链抗体IgG2,并免疫昆明小白鼠制备抗双峰驼总IgG和抗双峰驼重链抗体IgG2的多抗血清;通过ELISA检测双峰驼在体液免疫应答过程中针对spaA-N、溶菌酶和蒜氨酸酶3种抗原的重链抗体的滴度变化。结果从新疆双峰驼血清中亲和层析纯化出天然重链抗体IgG2,蛋白质分子质量约为46 ku;免疫昆明小白鼠后获得抗双峰驼总IgG多抗血清的效价为1∶204800,抗双峰驼重链抗体IgG2多抗血清的效价为1∶6400。在spaA-N免疫骆驼诱导的体液免疫应答过程中,重链抗体IgG2出现延迟反应。3种蛋白均能诱导抗原特异的IgG2亚类重链抗体的产生。 相似文献
10.
11.
抗非洲猪瘟病毒单链抗体的构建、表达及活性鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
制备抗非洲猪瘟病毒（ASFV）猪源单链抗体（ScFv）,并对其生物学活性进行鉴定,筛选出具有ASFV反应活性的猪源单链抗体（ScFv）,为ASFV的诊断提供新的材料。采集ASFV感染康复猪的外周血,分离淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,以此为模板通过PCR扩增得到猪源IgG重链可变区与轻链可变区基因,利用SOE-PCR技术扩增拼接得到猪源ScFv基因;构建pET-30a-ScFv表达载体,进行蛋白的表达与纯化,用ELISA和IFA鉴定ScFv抗体的反应活性。结果显示,成功扩增出猪源ScFv（VH-VLκ、VH-VLλ）基因,鉴定到1株与ASFV存在反应活性的ScFv（VH-VLλ11）抗体。结果表明,成功筛选到1株与ASFV存在反应活性的ScFv（VH-VLλ11）抗体,为ASFV诊断和防控提供了新型原材料。 相似文献
12.
抗猪SIgA单克隆抗体的研制 总被引：7，自引：0，他引：7
采用饱和硫酸铵盐析、SephadexG-200柱层析和离子交换柱层析技术，从猪初乳中提纯分泌型IgA(SIgA)。经SDS-PAGE电泳鉴定，纯化的SIgA达到电泳纯。以此纯化的SIgA，采用长程免疫法免疫BALB／c小鼠，取4次免疫后的脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞用PEG-1500进行细胞融合，第1次融合率为79．7％，第2次融合率为60．3％。建立间接ELISA，用于检测杂交瘤细胞上清中的单克隆抗体．初检阳性率分别为4．1％、16．8％。经2次亚克隆反复筛选获得了2株能稳定分泌抗猪SIgA单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为CA6、5D4。ELISA和Western-blotting证实，所获得的单抗能特异性针对SIgA。CA6、5D4经反复冻存、复苏及多次传代，仍能分泌高效价抗体．CA6分泌抗体属IgM、κ型，而5D4分泌抗体属IgG1、κ型。 相似文献
13.
《中国预防兽医学报》2017,(3)
为制备与猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)具有反应活性的猪源化原核表达抗体(Pr Ab),本实验通过流式细胞技术,以PRRSV GP5蛋白多肽及抗猪Ig G抗体,筛选出能够与PRRSV抗原表位结合的阳性B淋巴细胞,利用RT-PCR从筛选得到的B细胞的mRNA中扩增出编码抗体重链可变区(VH)基因序列和轻链可变区(VL)基因序列,将扩增的可变区基因序列分别与本实验室前期克隆的猪源抗体轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)基因序列连接后,以Linker序列将轻链和重链全长基因序列相连,构建全长的猪源抗体编码基因(H-linker-L)。将该基因克隆于原核表达载体p ET-28a中进行原核表达及纯化。Western blot鉴定结果显示,表达的重组蛋白能够被抗猪IgG抗体所识别,表明表达的重组蛋白为PrAb;经PRRSV包被的ELISA鉴定,PrAb与PRRSV弱毒株CH1R和强毒株HuN4呈阳性反应,表明所制备的PrAb为PRRSV特异性抗体。本实验为进一步制备诊断PRRS的猪源化重组抗体奠定了基础。 相似文献
14.
猪白细胞介素-6的原核表达及其生物学活性研究 总被引：1，自引：1，他引：0
本研究采用RT-PCR方法自细菌脂多糖(LPS)刺激的猪脾脏细胞总RNA中扩增、克隆猪白介素-6(porcine interleukin-6,PoIL-6)成熟肽基因,并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的重组融合猪白介素-6(rPoIL-6)蛋白通过尿素变性、低浓度复性液复性、PBS透析等步骤进行复性、纯化,采用PoIL-6 ELISA试剂盒检测rPoIL-6蛋白与抗PoIL-6单抗发生特异性免疫反应的活性;采用MTS法检测rPoIL-6蛋白促猪脾脏细胞的增殖活性。结果表明,成功克隆了全长555 bp的PoIL-6成熟肽基因;表达的rPoIL-6蛋白分子质量大小约20 ku;纯化后的rPoIL-6蛋白纯度在95%以上,可和抗PoIL-6单抗发生特异性免疫反应,并且具有显著促猪脾脏细胞增殖活性。 相似文献
15.
为制备猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus, PHEV)N蛋白的单克隆抗体，本研究构建了pET-32a-N重组质粒，原核表达并纯化重组N蛋白，免疫BALB/c小鼠，细胞融合后利用间接ELISA进行筛选，获得了3株稳定分泌的阳性杂交瘤细胞株，分别命名为2C3、4F3、5C6。Western blot与间接免疫荧光试验表明，3株单抗均能与293T细胞中表达的N蛋白产生特异性反应。经测定，3株单抗的效价均为1×106,重链类型均为IgG1,轻链类型均为κ。利用一系列表达的部分重叠的N截短蛋白片段，经Western blot鉴定单抗所识别的抗原表位，结果显示，267KPRQK271为单抗2C3、4F3、5C6所识别的表位。本研究为PHEV临床检测方法的建立和表位疫苗的研发奠定了基础。 相似文献
16.
孕牛血清中早孕因子的分离纯化 总被引：2，自引：0，他引：2
采用DEAE－Sepharose(DEAE-琼脂糖凝胶）、CM－Sepharose(CM-琼脂糖凝胶）等离子交换层析、抗孕牛全血清IgG-Sepharose 4B亲和层析等技术，分离纯化妊娠4－5个月健康孕牛全血清中的早孕因子（EPF），用玫瑰花环抑制实验对各阶段产物EPF活性进行检测。结果表明，经层析过柱后的CM－ⅡA提取物有EPF活性。经SDS－PAGE银染显色证实它含有分子量为21、67、80KD的蛋白，实验结果支持21KD的多肽为主要EPF活性物成分。同时实验表明了亲和层析对进一步纯化EPF是可行的。 相似文献
17.
以猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型25-4株基因组DNA为模板，PCR方法扩增外膜蛋白(OMP)5’末端保守区基因片段(OMPc)，酶切及核苷酸序列分析鉴定后，与原核表达载体质粒pGEX-6P-1进行连接，构建成重组表达载体pGEX-OM-Pc，转入大肠杆菌B121中，以IPTG进行诱导，SDS-PAGE电泳分析发现，转化了重组质粒的菌株所表达的融合蛋白相对分子量为34kD，与实际预测相符，命名为GST-OMPc。GST亲和层析柱进行纯化,ELISA方法对纯化蛋白进行检测。结果表明：纯化蛋白GST-OMPc能够与兔抗猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型的阳性血清反应。OMPc蛋白的成功表达为其功能的研究打下基础。 相似文献
18.
19.
猪水泡病病毒抗独特型抗体的研究—Ab2的制备与鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
用猪水泡病病毒中和单抗２Ｂ６和４Ｈ９免疫家兔，制备出ＳＶＤＶ兔抗独特型抗体。经亲和层析纯化，用ＥＬＩＳＡ鉴定性质，结果表明，所制备的Ａｂ２能竞争抑制Ａｂ１与ＳＶＤＶ抗原结合，同时，Ａｂ２与Ａｂ１的结合可被病毒抗原阻断，表明所制备的Ａｂ２具有ＳＶＤＶ抗原内影像关系。 相似文献