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1.
[目的]将安氏隐孢子虫肌动蛋白基因进行克隆和在Hela细胞中真核表达。[方法]根据筛选安氏隐孢子虫T7噬菌体展示文库获得的肌动蛋白(CA42)部分编码基因序列设计特异性引物,扩增目的基因CA42,构建重组真核表达载体pVAX1-CA42,将其转化入Hela细胞,用间接免疫荧光、SDS-PAGE、Western blotting检测CA42蛋白在转染细胞中的表达情况。[结果]重组质粒能在Hela细胞中表达,且表达产物具有反应原性。[结论]成功克隆并表达了安氏隐孢子虫肌动蛋白基因,并在Hela细胞中能够稳定表达。 相似文献
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[目的]将安氏隐孢子虫肌动蛋白基因进行克隆并在Hela细胞中真核表达。[方法]根据筛选安氏隐孢子虫T7噬菌体展示文库获得的肌动蛋白(CA42)部分编码基因序列设计特异性引物,扩增目的基因CA42,构建重组真核表达载体pVAX1-CA42,将其转化入He-la细胞,用间接免疫荧光、SDS-PAGE、Western blotting检测CA42蛋白在转染细胞中的表达情况。[结果]重组质粒能在Hela细胞中表达,且表达产物具有反应原性。[结论]成功克隆并表达了安氏隐孢子虫肌动蛋白基因,并在Hela细胞中能够稳定表达。 相似文献
3.
为检测气肿疽梭菌中NagH基因的核酸疫苗的免疫效果,在成功构pVAX1-NagH真核表达重组质粒后,将其转染至Vero细胞,通过间接免疫荧光方法对重组体进行鉴定.鉴定成功后,大量提取重组体质粒,对BALB/c小鼠进行免疫,免疫方法为肌肉注射.设置pVAX1-NagH核酸疫苗组、载体对照组以及PBS阴性对照组.对小鼠采血... 相似文献
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《扬州大学学报(农业与生命科学版)》2016,(2)
以卡介苗(BCG)基因组、pEGFP质粒为模板,PCR扩增分别获得TB10.4基因片段、GFP-TB10.4融合基因片段,连接pVAX1真核表达载体,测序和酶切鉴定正确,分别命名为pVAX1-TB10.4和pVAX1-GFP-TB10.4;将重组质粒分别转染COS-7和HEK293T细胞,反转录PCR表明TB10.4基因成功转录,间接免疫荧光试验显示2种蛋白均能瞬时表达;再将重组质粒pVAX1-TB10.4免疫小鼠。结果表明:该质粒能够诱导低水平的抗体应答,同时诱发IFN-γ表达,并且能够加强BCG初次免疫后的免疫应答效果。该研究构建的真核表达质粒pVAX1-TB10.4能够诱导小鼠产生抗TB10.4免疫应答,为后续TB10.4蛋白生物学功能研究提供良好的生物材料。 相似文献
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鸡传染性支气管炎病毒S1基因的真核表达及其产物的免疫原性 总被引：4，自引：0，他引：4
采用RT-PCR扩增出鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M 41株的全长S1基因,并将其片段连接到pGEM-T载体,经酶切、PCR及序列测定表明,获得的S1基因ORF全长为1 659 bp,与G enB ank上公布的IBV M 41 S1基因序列一致。将S1基因与真核表达质粒pVAX 1连接,构建重组真核表达质粒pVAX 1-S1。将重组质粒转染COS-7细胞,采用间接免疫荧光检测转染细胞S1蛋白的表达。同时以重组质粒免疫小鼠,可诱导产生特异性针对IBV S1蛋白的抗体(P<0.01)。这为鸡传染性支气管炎新型基因工程疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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《特产研究》2020,(2)
为研制安全有效的水貂阿留申病毒(ADV)VP2核酸疫苗,本研究构建了不含有形成抗原抗体复合物表位的VP2核酸疫苗以及IL-12、IFN-γ细胞因子真核表达质粒,在体外细胞水平鉴定上述目的基因的表达情况。首先,以各克隆质粒为模板,PCR扩增获得ADV的VP2主要抗原表位M、鼠IL-12和IFN-γ的基因片段,连接至pVAX1载体,经酶切及测序鉴定后,确定构建正确;其次,将真核表达质粒转染入293T细胞,通过间接免疫荧光及Western Blot分析表达情况。结果显示:pVAX1-M可正常表达,并且目的蛋白可与ADV阳性血清结合,具有良好的反应原性。含细胞因子的真核表达质粒pVAX1-IL及pVAX1-IF转染293T细胞后,通过间接免疫荧光、Western Blot及ELISA分析证明,目的蛋白可在体外正常表达,且具有生物学活性。本研究可为水貂阿留申病核酸疫苗深入研究奠定基础。 相似文献
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应用RT-PCR技术从植物血凝素（PHA）活化的牛外周血淋巴细胞中扩增出牛白细胞介素4（IL-4）特异性目的片段,将其克隆到真核表达载体pVAX1,双酶切及测序鉴定正确后,将构建好的重组质粒pVAX1-IL-4应用脂质体Lipofectamine”2000转染至293T细胞,经RT-PCR检测IL-4可进行转录表达,且MTT检测其具有生物学活性,表明IL-4在转染细胞中可以成功表达。然后将构建好的pVAX1-IL-4作为基因佐剂来研究其对牛病毒性腹泻粘膜病毒（BVD）核酸疫苗pVAV1-E0的免疫增强作用。经ELISA和MTT检测结果表明,pVAX1-IL-4同pVAV1-E0联合免疫组小鼠的特异性抗体水平、淋巴细胞增殖水平与pVAV1-E0单疫苗免疫组相比差异显著（P〈0．05）。证明重组质粒pVAX1-IL-4可作为佐剂与核酸疫苗共同作用来提高后者的免疫原性。 相似文献
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为构建稳定表达猪δ冠状病毒（PDCoV）S1蛋白的CHO细胞系，利用电转染技术将重组质粒pCGS3-S1转染至CHO细胞，通过有限稀释法筛选稳定表达重组S1蛋白的单克隆细胞系。利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析方法对重组S1蛋白进行纯化，采用间接ELISA方法检测重组S1蛋白活性。将纯化的重组S1蛋白免疫BALB/c小鼠，通过间接ELISA、间接免疫荧光试验（IFA）及病毒中和试验对重组S1蛋白免疫原性进行检测。结果显示，稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO细胞系成功建立，并获得了纯度高于90%、产量为28.5 mg/L的重组S1蛋白；且重组S1蛋白与PDCoV阳性血清反应性良好，具有良好的免疫原性，中和效价为1∶128。综上，成功建立了稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO细胞系，且纯化获得的重组S1蛋白具有良好的生物学活性。 相似文献
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收集贵州省思南县某猪场送检的哺乳仔猪病料,采用Vero细胞盲传、核酸鉴定及测序分离到1株伪狂犬病病毒贵州分离株。扩增其gE基因主要抗原表位区,构建pcDNA3．1（＋）－gE重组真核表达质粒,将其转染Vero细胞,采用间接免疫荧光（IFA）检测基因在Vero细胞中的表达,同时将重组质粒免疫BALB／c小鼠,进行免疫学评价。结果表明：萨基因主要抗原表位区在Vero获得瞬时表达,转染的Vero细胞呈特异性绿色荧光;将构建的重组真核表达质粒免疫BALB／c小鼠,经间接ELISA和T淋巴细胞亚群含量测定表明,重组质粒具有较好的免疫原性。 相似文献
11.
为构建牛瑟氏泰勒虫双拷贝p23表面蛋白基因真核表达质粒,根据GenBank牛瑟氏泰勒虫p23表面蛋白基因序列（D84447）,分别设计2对特异性引物,利用全血基因组DNA提取试剂盒提取牛瑟氏泰勒虫基因组DNA,采用SOE—PCR技术构建双拷贝p23基因,克隆到pMD-18-T载体上,经过PCR、酶切鉴定及测序后,亚克隆到pVAX-Ⅰ真核表达载体上,经过鉴定后采用脂质体法将重组质粒pVAXI-2p23转染到BHK-21细胞,用IFA和RT—PCR来鉴定目的基因的表达情况．结果表明,成功构建了牛瑟氏泰勒虫双拷贝p23表面蛋白基因真核表达质粒,并在BHK-21细胞中获得表达． 相似文献
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重叠延伸PCR法扩增猪囊尾蚴AgB基因及其在BHK-21细胞中的表达 总被引：3，自引：1，他引：2
【目的】克隆猪囊尾蚴AgB基因并在体外细胞中表达。【方法】采用 RT-PCR法分别扩增AgB基因的上半段和下半段序列。采用重叠延伸PCR法（splicing overlap extension PCR method,SOE-PCR）把具有35个相同碱基的上下半段扩增为全长基因,并构建到真核表达载体pVAX1,将酶切、PCR、测序鉴定的阳性质粒经脂质体转染 BHK-21细胞。通过SDS-PAGE、Western-blotting、间接免疫荧光法,检测细胞中B抗原的表达。【结果】琼脂糖凝胶电泳显示扩增的不同片段大小分别与预期的相同。重组表达载体转染BHK细胞后有荧光出现。表达的蛋白能被猪囊尾蚴病阳性血清所识别。【结论】通过重叠延伸PCR法成功扩增了AgB基因全长并构建到真核表达载体,目的蛋白在BHK-21细胞中表达。 相似文献
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为了提高猪生殖与呼吸综合征病毒山东株(PRRSV SD2株)基因免疫的效果,将PRRSV SD2 E基因插入哺乳动物表达载体PVAX1中,构建出PVAX1-E质粒。再将已筛选出的CpG-ODN序列通过在其两端的粘性酶切末端定向插入含PVAX 1-E的真核表达载体,构建含CpG基因序列真核重组表达质粒CpG-pVAX 1-E。将重组质粒转染COS-7细胞,经RT-PCR检测E基因mRNA的转录和间接免疫荧光试验(IFA)证实:CpG-pVAX 1-E可表达PRRSV GP5蛋白。试验结果为进一步研究PRRSV SD2 ORF5动物免疫反应奠定基础。 相似文献
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原核真核双表达加强型绿色荧光蛋白质粒的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
将原核启动子Ptrc和加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因从EGFP原核表达质粒pYA3334—EGFP上切下，然后将其插入至真核表达质粒pVAXI真核启动子Pcmv的下游，构建成具有真核和原核启动子的双表达杂合质粒pVAXD-EGFP，其长度为3823bp。将pVAXD—EGFP分别转化鼠伤寒沙门氏菌X4550和转染COS—7细胞，应用流式细胞术、可见光谱扫描、SDS—PAGE测定EGFP原核表达；应用荧光显微镜观察EGFP在COS—7细胞内的表达。重组鼠伤寒沙门氏茵X4550(pVAXD-EGFP)表达EGFP的量与仅以原核方式表达EGFP的X4550(pYA3334—EGFP)相当；将质料pVAXD-EGFP转染COS—7细胞，EGFP可在COS—7细胞核和胞浆表达，在荧光显微镜下发出强烈荧光。结果表明：不仅成功地构建原核、真核表达集中于同一质粒的新型质粒pVAXD-EGFP，而且原核、真核目的蛋白表达量达到很高水平，显示其在新型重组细菌疫苗方面有着诱人的应用前景。 相似文献
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为探明原核表达的重组猪IL-10对仔猪的免疫原性,根据GenBank公布的猪IL-10基因序列(登录号:L20001)设计并合成了扩增猪IL-10基因的引物。利用ConA刺激猪外周血淋巴细胞,通过RT-PCR扩增出pmIL-10完整基因及其成熟蛋白基因片段(pmIL-10),分别插入质粒pVAX1和pET32α(+),对猪IL-10基因进行原核与真核表达。利用纯化的重组蛋白免疫仔猪,制备抗血清,利用间接ELISA检测血清效价。将pVAX-pIL-10转染COS-7细胞,利用RT-PCR检测pmIL-10的转录,以间接免疫荧光(IFA)鉴定其与原核表达产物制备抗体之间的反应。结果显示:该试验成功获得了猪IL-10基因,重组菌pET-pmIL-10/Rosetta经IPTG诱导后,猪IL-10获得表达,目的蛋白表达量以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的39.7%;以白油佐剂重组蛋白免疫仔猪可产生高水平的抗猪IL-10的抗体,经ELISA检测,P/N值可达到8,OD630吸光值可达1.875,该抗体与转染pVAX-pmIL-10的COS-7细胞发生明显的荧光反应,说明原核表达的重组猪IL-10免疫产生的抗体具有生物学活性,为日后利用猪IL-10抗体消除病毒感染中产生的内源性IL-10研究奠定了基础。 相似文献
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家猫能自然及人工感染SARS病毒,本研究旨在探讨家猫ACE2潜在的SARS病毒受体功能。以人血管紧张素转换酶2(ACE2)序列为模板,用同源模建法模拟了家猫ACE2的三维空间结构,发现家猫ACE2与人ACE2结构十分相似,其结合严重急性呼吸综合症(SARS)病毒囊膜纤突(S)蛋白的关键氨基酸的同源性很高(15/18)。将家猫血管紧张素转换酶2基因N端1-367 aa对应的基因片段及其跨膜区克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-his( )B中,构建了表达质粒pcDNA-mA367,转染HeLa细胞,间接免疫荧光检测表明fACE2的N端片段已在细胞膜上成功表达。 相似文献
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利用PCR技术将鸡痘病毒env基因亚克隆到pVAX1真核载体上,构建了含有该基因的真核表达质 粒pVAX-env。将质粒pVAX--env体外瞬时转染BHK21细胞通过间接免疫荧光检测蛋白表达。将pVAX-env质粒肌肉注射免疫14日龄雏鸡,通过RT-PCR和组织免疫荧光检测体内质粒表达。结果表明,成功构建了真核表达质... 相似文献
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【目的】克隆鸭维甲酸诱导基因I（retinoic acid inducible gene I,RIG-I）,分析其不同结构域的功能。【方法】根据GenBank上公布的鸭RIG-I序列设计引物,利用RT-PCR克隆鸭RIG-I基因CDS（coding sequence）区,根据保守结构域预测结果,构建携带6*his组氨酸标签的不同结构域缺失突变体的真核表载体（RIG-I-Full、RIG-I-N和RIG-I-C）,转染鸡胚成纤维细胞DF1,经RT-PCR、间接免疫荧光方法鉴定重组质粒在细胞中转录与表达;同时,利用RT-qPCR检测RLR抗病毒信号通路中的IFN-β、Mx1和PKR等下游基因的表达变化。【结果】鸭RIG-I基因CDS区全长2 802 bp,共编码933个氨基酸;不同结构域缺失突变体的真核表载体转染DF1细胞后,重组蛋白均在DF1细胞中表达;RT-qPCR结果显示,N端能显著激活RLR通路上IFN-β、Mx1及PKR基因的表达上调。【结论】 duRIG-I及不同区段均能在DF1细胞中表达,其中N端在调节RLR抗病毒信号通路下游基因的表达过程中发挥了重要作用。 相似文献
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为了研究鼠疫DNA疫苗pVAX1/F1-V质粒的安全性,试验运用SDS-PAGE电泳和琼脂糖电泳等方法检测了鼠疫DNA疫苗pVAX1/F1-V质粒的纯度,并以小鼠为动物模型进行了质粒pVAX1／F1-V的急性毒性和长期毒性试验,用PCR方法检测外源基因在小鼠组织中的分布情况,用ELISA、EIISPOT方法检测了其自身的免疫反应。结果表明,提取的质粒pVAX1/F1-V未检测到核酸及菌体蛋白污染;注射初期质粒pVAX1/F1-V 主要分布于注射部位的肌肉组织,其他组织有散在分布;小鼠接种4周后,质粒pVAX1/F1-V仅分布于注射部位。小鼠注射pVAX1/F1-V质粒后未产生明显的毒副反应及自身免疫损伤,也未检测到自身抗体。初步证明鼠疫DNA 疫苗pVAX1/F1-V安全性良好,为鼠疫菌新型DNA疫苗的应用奠定了基础。 相似文献