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1.
《中国兽医学报》2018,(11)
为探讨建立基于Mo Hsp70C末端蛋白检测绵羊肺炎支原体(Mo)感染或疫苗免疫抗体有效方法的可能性。本研究对Mo Hsp70C末端蛋白基因进行原核表达,采用亲和层析技术对表达产物进行蛋白纯化,Western blot和琼脂扩散试验检测纯化效果和抗原反应性。基于纯化目的蛋白构建检测Mo血清抗体的间接ELISA方法。结果显示:成功表达并纯化出Mo Hsp70C末端蛋白,大小约27 000,琼脂扩散试验表明纯化的目的蛋白具有良好的抗原反应性。基于纯化的Mo Hsp70C末端蛋白,成功构建间接ELISA方法,其最佳体系蛋白质量浓度为10mg/L、血清稀释度1∶5;抗原包被条件37℃1h、室温12h、封闭液5%脱脂奶粉、封闭时间1.5h;临界值为0.588。间接ELISA方法性能评价显示本研究所建立的ELISA方法具有较好的特异性、敏感性和可重复性,可用于临床样本检测,为Mo疫苗免疫和疫病诊断提供可行手段。 相似文献
2.
旨在建立检测血清大豆抗原蛋白抗体的间接ELISA方法。经琼脂糖凝胶层析纯化大豆抗原蛋白,以不同剂量皮下注射免疫小鼠,采用方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其他条件进行优化,最终建立检测血清大豆抗原蛋白抗体的间接ELISA方法,利用该方法检测小鼠免疫后血清抗体水平。通过方阵滴定法确定11S蛋白最佳包被浓度为5.0μg/mL,血清稀释倍数为1∶800;7S蛋白抗原最佳包被浓度为2.5μg/mL,血清稀释倍数为1∶1 600;两者的批内、批间系数均小于10%,重复性较好,通过ELISA法确定11S和7S蛋白的最佳免疫次数为2次,免疫剂量为1 000μg/kg。结果表明本试验初步建立大豆抗原蛋白抗体检测间接ELISA方法,具有很强的特异性、敏感性和重复性,可用于大豆抗原蛋白过敏反应的临床检测。 相似文献
3.
为建立快速检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的血清学方法,本试验以IBV为检测抗原,建立了一种检测IBV抗体的间接ELISA方法,并对各种检测条件进行了优化.研究结果显示,抗原的最佳包被浓度为19.2 μg/mL,最佳包被条件为37 ℃ 1 h后4 ℃过夜;血清的最佳稀释度为1:800,37 ℃孵育60 min;酶标二抗稀释度为1:7 000,37 ℃孵育60 min;底物显色为37 ℃避光作用10 min.经特异性、重复性、敏感性试验证明,该方法与鸡常见病原的阳性血清均无交叉反应,重复性较好及血清稀释至1:12 800时仍可检测到IBV抗体.结果表明,本试验所建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、重复性和敏感性. 相似文献
4.
为建立可检测边缘无形体（Anaplasma marginale）的血清学检测方法,该研究根据GenBank收录的边缘无形体MSP2基因序列（登录号：EU526889）,构建重组质粒pET28a-MSP2,原核表达获得pET28a-MSP2重组蛋白,将纯化后的蛋白作为抗原,建立间接ELISA检测方法。结果显示,该研究建立的间接ELISA方法,抗原最佳包被浓度、血清最佳稀释度和酶标二抗最佳工作浓度分别为8μg/mL、1∶400和1∶2 000,特异性、灵敏性和重复性良好。本试验成功表达并纯化了边缘无形体的MSP2蛋白,并建立了边缘无形体抗体间接ELISA方法,为边缘无形体的监测和诊断提供参考。 相似文献
5.
为原核表达牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)NX49株截短NP融合蛋白并以此建立间接ELISA检测方法,本研究采用RT-PCR方法扩增了BPIV3截短NP蛋白基因序列并克隆至p ET-28a中进行诱导表达,纯化后产物进行Western blot分析。以重组蛋白作为包被抗原,建立并优化检测BPIV3抗体的间接ELISA方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行验证。结果成功表达出截短的NP重组蛋白,该重组蛋白具有良好的反应原性。间接ELISA优化结果如下:抗原包被浓度为4μg/m L,37℃包被1 h后4℃过夜,待检血清以1:80倍稀释37℃孵育1 h,5%脱脂乳37℃封闭1 h。二抗以1:5 000倍稀释37℃孵育1 h,TMB显色时间为15 min。以该蛋白为包被抗原建立的间接ELISA检测方法其特异性为97.4%,敏感性为95.3%,批内、批间检测结果变异系数均小于10%。本试验成功建立检测BPIV3抗体的间接ELISA方法,该方法具有较强的特异性、良好的重复性及敏感性,为开展牛呼吸道疾病综合征的流行病学调查、实验室诊断奠定了基础。 相似文献
6.
原核表达A型副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum serotype A,Hpgserotype A)的血凝素蛋白HA,并以HA蛋白为包被抗原,建立血清间接ELISA检测方法。克隆Hpg HA基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中进行重组HA蛋白的诱导表达,对表达产物进行纯化,并进行Western blot鉴定;用纯化后的HA蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立血清间接ELISA检测方法,并进行特异性、灵敏度和重复性试验,最后对临床样品进行检测。原核表达获得大小约为37ku的重组HA蛋白;Western blot结果表明重组蛋白具有良好的特异性和抗原反应性。Hpg间接ELISA优化反应条件为:抗原包被量每孔500ng,血清以1∶200倍稀释作用1h,酶标二抗以1∶2 500倍稀释作用1h,TMB显色时间为10min。在该优化条件下,OD_(450)≥0.34为阳性,反之为阴性;特异性试验结果表明对鸡新城疫病毒、禽流感病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌阳性血清检测均为阴性;对85份阳性血清进行检测,敏感性为98.8%;重复性试验结果表明,批内和批间OD_(450)值的变异系数分别1.5%~3.7%和6.5%~8%。用本试验建立的方法对临床上215份鸡血清样品进行检测,阳性率为25.1%。说明建立的ELISA检测方法可用于Hpgserotype A抗体水平的检测。 相似文献
7.
为建立绵羊支原体(Mycoplasma ovis)的血清学检测方法,根据GenBank收录的绵羊支原体HSP70蛋白C端的基因序列(登录号：CP006935.1),构建了重组原核表达质粒。通过原核表达获取重组蛋白,并将纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立了绵羊支原体间接ELISA抗体检测方法。结果显示,成功构建了绵羊支原体HSP70蛋白的重组原核表达质粒;重组蛋白在大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞中,同时以可溶性蛋白和包涵体蛋白的形式表达;以重组蛋白作为包被抗原建立的绵羊支原体间接ELISA抗体检测法,抗原包被最佳浓度为4μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,酶标二抗最佳稀释度为1∶2 000。建立的ELISA方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,为绵羊支原体的检测及试剂盒的开发提供了技术支持。 相似文献
8.
重组N蛋白抗原检测美洲型PRRSV抗体间接ELISA方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
利用表达纯化的PRRSV特异N蛋白抗原表位基因的重组融合蛋白作为抗原,建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。研究结果表明重组N蛋白的最适包被浓度为4.5μg/mL,最适包被条件为37℃1 h加4℃过夜,待检血清稀释度为1:40,HRP-兔抗猪IgG(1:1000)37℃孵育30min。经重复性试验、交叉试验等试验结果表明该方法重复性好、特异性强、灵敏度高,与武汉科前ELISA试剂盒的符合率达93.2%。用已建立的方法检测2007年以前临床血清样本983份,总阳性率为48.6%。 相似文献
9.
以纯化的鹅副黏病毒NP蛋白为包被抗原,建立了检测鹅副黏病毒NP蛋白抗体的间接ELISA方法,并确定了间接ELISA的最适反应条件：抗原包被浓度为1.0μg/mL,血清稀释度为1∶200,兔抗鹅IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1∶2 000,抗原和血清、血清和二抗均于37℃反应1 h,底物于37℃显色15 min。此间接ELISA方法的特异性强、重复性好。应用该方法对试验鹅血清进行检测,以HI试验为参照。经统计学处理后,比较了两方法测得的抗体效价,分别建立了各组鹅群的回归方程。显著性检验证明,这两种方法检测的抗体效价呈显著相关关系。 相似文献
10.
猪圆环病毒2型CaP蛋白的表达及在ELISA中的初步应用 总被引：2，自引：0，他引：2
本研究旨在建立以PCV2 Cap蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因原核表达质粒pET32a-ORF2并转化至Rosetta菌,在1.0 mmol·L-1 IPTG和37℃条件下诱导下,Cap蛋白获得高效表达,Western blot检测证实其具有免疫反应活性,以纯化的蛋白为抗原建立了检测猪圆环病毒2型抗体的间接ELISA方法.结果表明抗原最适包被浓度为2.16μg·mL-1;血清最佳稀释度为1:40;抗原最佳包被条件为4℃过夜;最佳封闭条件为1%BSA 37℃1 h;血清反应时间为37℃30 min;酶标二抗最适作用时间为37℃45 min;底物最佳反应条件为37℃显色15 min.用该方法对四川省184份猪血清样品进行检测,总阳性率为80.98%(149/184),与商品化的PCV2 ELISA试剂盒得到的结果基本一致.本试验成功建立了PCv2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,可用于大规模的血清学检测. 相似文献
11.
为建立检测血清中非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFV p30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFV p30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a （+）中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2 μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1：100,最佳封闭液为1% BSA,酶标抗体最佳稀释度为1：4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1：1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均<10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。 相似文献
12.
为建立以重组PCV2Cap蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,构建了猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因原核表达质粒pET28a-ORF2。SDS-PAGE显示,在0.1mmol/L IPTG和37℃条件下诱导4h,重组Cap蛋白高效表达。Western blotting证实该蛋白能够被PCV2阳性血清特异性识别。以纯化的蛋白为抗原建立了检测PCV2抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原最适包被质量浓度为2mg/L;血清最佳稀释度为1∶100;酶标二抗最适浓度为1∶2 000,该方法的敏感性为86.96%,特异性为100%。用该方法对河南省152份猪血清样品进行检测,与间接免疫荧光（IFA）的符合率为85.53%（130/152）,与商品化的韩国金诺PCV2ELISA试剂盒的符合率为88.16%（134/152）。本试验成功建立了PCV2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,可用于大规模的血清学检测。 相似文献
13.
ZHENG Wei-feng YAN Fang WANG Pan ZHAO Yu-jun GAO Wen-wei MA Hai-li LI Xu-ying NING Guan-bao TIAN Wen-xia LIANG Hui-xia LIU Lin 《中国畜牧兽医》2015,42(6):1383-1388
The purpose of this research was to establish a rapid detection serological method against avain infectious bronchitis virus (IBV).In this study,an indirect ELISA method was established using IBV as the detected antigen and a variety of testing conditions were optimized.The results showed that the optimal antigen coating concentration was 19.2 μg/mL and the optimal condition for coating was incubated at 37 ℃ for 1 h and then 4 ℃ overnight.The optimal dilutions of serum and enzyme labeled antibody were 1:800 and 1:7 000 incubated at 37 ℃ for 60 min,respectively.The optimal condition of chromogenic substrate was incubated at 37 ℃ for 10 min in the dark.The specificity,repeatability and sensitivity tests proved that the indirect ELISA did not cross-react with positive antiviral sera of other chicken diseases,had good repeatability and could detect IBV antibody when serum was diluted 1:12 800.We concluded that the established indirect ELISA was specific,repeatable and sensitive. 相似文献
14.
本试验采用121 ℃高压处理副猪嗜血杆菌4型和5型耐热蛋白,混合作为包被抗原,建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法。通过对试验条件进行筛选优化,确定了最佳反应条件:抗原包被浓度为10 μg/mL,37 ℃包被2 h;封闭液选择含20 g/L脱脂奶粉的PBST,封闭30 min;血清的稀释度为1∶80;抗原抗体反应时间为45 min;酶标二抗稀释度为1∶12000,作用时间为30 min;底物显色时间为15 min。特异性、重复性和敏感性试验及对200份送检血清的检测结果表明,建立的间接ELISA方法特异性和重复性良好,敏感性比间接血凝试验高,对已知阴阳性血清的临床样本检测结果与国外ELISA试剂盒一致,可用于副猪嗜血杆菌的血清抗体检测和血清流行病学调查。 相似文献
15.
研究旨在原核表达气肿疽梭菌细胞毒素A （CctA）基因,用纯化的重组蛋白建立其间接ELISA检测方法,a。利用大肠杆菌密码子的偏爱性优化CctA基因序列,克隆至原核表达载体pET-28a （+）,双酶切鉴定原核表达质粒pET28a-CctA并测序。将重组质粒转入大肠杆菌,经IPTG诱导得到高表达的重组CctA包涵体蛋白。包涵体蛋白变性后经镍（Ni）柱纯化,SDS-PAGE检测其纯化效果。以豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清为一抗,用Western blotting方法检测重组CctA蛋白的反应原性。用棋盘滴定法建立间接ELISA检测方法,以复性后的重组CctA蛋白作为检测抗原,摸索抗原包被浓度、封闭液的种类及浓度、抗体的最适稀释度和反应条件等。选用3批气肿疽灭活疫苗免疫豚鼠后采集血清,同时用攻毒和间接ELISA两种方法验证疫苗的免疫效力。质粒双酶切结果显示,得到大小约853 bp的条带,与预期相符,且测序结果正确。SDS-PAGE结果表明,成功表达并纯化大小为35 ku的重组CctA蛋白。Western blotting结果显示,豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清与重组CctA蛋白具有良好的反应原性。建立的间接ELISA法的最适条件为：抗原的包被浓度为0.5 μg/mL,于4 ℃包被过夜;封闭液选择10%胎牛血清,37 ℃孵育2 h;二抗的稀释度为1：8 000;室温避光显色10 min后终止反应,测定D450 nm值。当P/N>4.6时,间接ELISA法检测结果与豚鼠攻毒试验结果拟合度较好。本研究成功表达CctA基因并纯化了重组CctA蛋白,建立的以重组CctA蛋白为检测抗原的间接ELISA检测方法,有望成为气肿疽灭活疫苗免疫效果验证的替代方法。 相似文献
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利用纯化的 Ⅰ 群禽腺病毒4型重组Hexon蛋白,通过各反应条件筛选,建立了 Ⅰ 群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法.结果显示,抗原最佳包被浓度为1μg/mL;最佳封闭液为1% 牛血清白蛋白;待检血清最佳作用浓度是400倍稀释,37℃孵育60 min;酶标抗体的最佳作用条件为稀释度1:8000,37℃孵育60 min;最佳显色时间为10 min.用所建方法对160只临床鸡只进行检测,同时与拭子PCR检测对比,一致性较好,表明该方法可有效用于临床检测. 相似文献
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以TTMV重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了检测人TTMV血清抗体的间接ELISA方法,结果显示：抗原最佳包被浓度为1．63μg／mL,37℃孵育1h后4℃过夜;血清稀释度为1：320;酶标二抗孵育时间为37℃60min;ELISA酶标板的临界值为0．211。运用该方法对上海市和辽宁省共计280份血清样品进行检测,阳性检出率分别为34．68％和39．74％。检测结果表明,建立的间接ELISA方法特异性与重复性均较好,为进一步完善TTMV临床诊断方法打下了基础。 相似文献
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本研究利用纯化的原核表达乙型脑炎囊膜E蛋白作为包被抗原,建立了乙型脑炎间接ELISA诊断方法。对检测的各种条件进行了优化,优化反应条件后确定的抗原最适包被浓度为2μg/mL,抗原最佳包被条件为37℃包被2 h,血清的最适稀释度为1∶160,酶标抗体最适稀释度为1∶5000,最佳封闭条件为1%BSA,阴阳性临界值判定标准为D492 nm=0.254。该方法不与猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒阳性血清反应,其D492 nm0.254,说明该方法具有良好的特异性。采用该方法对150份疑似乙型脑炎血清样品进行检测,结果显示,与某猪乙型脑炎试剂盒相比符合率为90.77%,表明建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性,因此,本研究成功建立了能特异性检测抗乙型脑炎血清抗体的ELISA检测方法。 相似文献
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为建立骆驼斯氏副柔线虫病间接ELISA （iELISA）诊断方法,本试验对骆驼斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶CPR基因进行重组表达,将获取的重组蛋白（rCPR）进行纯化和Western blotting检测,然后以纯化好的重组蛋白为抗原,通过棋盘滴定试验优化了抗原包被浓度、包被条件、抗体稀释度、酶标二抗稀释度、封闭液和封闭时间等,建立了骆驼斯氏副柔线虫病iELISA诊断方法,并对建立的iELISA检测方法进行了重复性、敏感性、特异性试验和临床检测。结果显示,抗原最佳包被浓度为8 μg/孔,血清最佳稀释度为1：50,酶标二抗最佳稀释度为1：5 000,最佳包被条件为4℃包被过夜,最佳封闭条件为3% BSA封闭2 h。临界值为0.235,待检血清D450 nm值>0.235则确定为阳性。重复性试验中变异系数均<10%,重复性较好;用该方法检测阳性血清的敏感性为96.3%;此方法仅与骆驼斯氏副柔线虫病阳性血清发生特异性反应,与感染了其他寄生虫的阳性血清无交叉反应,特异性为100%;对140份临床血清进行检测,阳性率为86.4%。综上可知,本试验成功建立了一种快速有效诊断骆驼斯氏副柔线虫病的iELISA方法。 相似文献