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猪轮状病毒中国分离株JL94 VP7基因的克隆与序列分析 总被引：3，自引：0，他引：3
用MA104细胞培养增殖了轮状病毒地方分离株JL94,利用一对根据Genebank中已发表的轮状病毒VP7基因cDNA序列而设计并合成的引物，通过反转录-聚合酶链反应(RT—PCR)从JL94毒株扩增出VP7基因全长cDNA。将其插人pMD18-T载体中，构建了重组质粒pMD18-T—JL94／VP7，并对其进行了Hind Ⅲ，HindⅡ和BamH I的单、双酶切初步鉴定及其核苷酸序列测定，证明克隆的pMD18-T—JL94／VP7为轮状病毒的VP7基因。通过核苷酸序列比较，JL94／VP7与A群猪轮状病毒C134／VP7、OSU／VP7、ICB2185／VP7、YM／VP7核苷酸序列同源性分别为87％、99％、74％和83％。 相似文献
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猪轮状病毒地方株JL94株VP4基因的克隆与序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
根据GenBank已发表的猪轮状病毒VP4基因保守序列,利用Oligo4.1软件设计一对引物扩增猪轮状病毒地方株JL94株VP4全基因序列;并将扩增产物与pMD-18T载体连接,经鉴定后将重组质粒进行测序并与国外分离株CRW-8株、BEN-307株进行核苷酸和氨基酸序列同源性比较分析.结果表明:JL94株和CRW-8株、BEN-307株VP4全基因片段核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为96.98%和98.05%,说明JL94株与CRW-8株、BEN-307株属于同一VP4血清型.本研究为进一步研制诊断性抗原和病毒重组活载体疫苗奠定了基础. 相似文献
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为弄清2013年年初上海某猪场发生的仔猪腹泻疫情病因,本研究随机采集发病猪场的仔猪腹泻样品9份,利用RT-PCR方法对采集样品进行病原检测。结果显示,9份临床样品中有4份为猪轮状病毒阳性,而猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒均为阴性。根据GenBank公布的猪轮状病毒参考株序列设计两对引物,对其中阳性样品的VP6和VP7基因进行RT-PCR扩增、基因克隆和序列测定分析。结果显示,4份阳性样品的VP6基因大小为1356 bp,VP7基因大小为1100 bp;序列分析结果显示,VP6基因与A群代表株OSU的氨基酸同源性为64.1%~87.0%,与代表株Gottfriend的氨基酸同源性为26.3%~60.8%;VP7基因与不同G型代表株的氨基酸同源性为71.8%~97.3%。根据上述结果分析,我们推测引起此次仔猪腹泻疫情中的主要病原是由属于A群G9血清型的猪轮状病毒引起,本研究为此次仔猪腹泻疫情的诊断提供了依据。 相似文献
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《中国兽医杂志》2019,(12)
为了对犬细小病毒临床分离株的VP2基因进行遗传变异分析,了解本地区犬细小病毒流行的优势型别及病毒变异情况。采集2例患犬细小病毒病的动物粪便,提取病毒基因组,设计特异性引物,PCR扩增VP2基因,对扩增产物测序,对序列结果与同属其他毒株VP2基因序列用MEGA 7和MegAlign进行同源性分析和遗传进化分析。同时比较其氨基酸变异情况。结果显示,PCR扩增出VP2基因,测序结果显示大小为1 755 bp,2株病毒VP2基因NCBI序列登录号分别为MH155192和MH155193, MH155192与MF467233.1和JQ743891.1的核苷酸同源性为99.9%,MH155193与KY937651.1、KP260509.1、KY937641.1核苷酸同源性为99.8%。MH155192主要位点氨基酸分别为为267Y,324I,370Q,426D,440A。MH155193主要位点氨基酸分别为267Y,324I,370R,426E,440T。且2株病毒297位均为A。表明分离到的2株病毒分别为新CPV-2b和CPV-2c型。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2021,(9)
为了对患腹泻疾病的犊牛进行病原学鉴定,并进一步丰富我国牛轮状病毒(BRV)的流行病学数据,本研究采用RT-PCR方法对8份腹泻犊牛的粪便样品进行BRV VP7基因检测,结果显示有1份样品为阳性。将该阳性病料样品接种Marc-145细胞。对产生细胞病变(CPE)的阳性样品连续传5代后,经间接免疫荧光试验(IFA)和电镜观察,结果表明从粪便样品中分离的病毒为BRV,命名为DZ株。对DZ株的11个基因节段进行RTPCR扩增、测序、拼接后对11个基因节段进行同源性及分型分析;构建分离病毒VP7、VP4基因进化树,分析其遗传进化关系及其氨基酸序列的变异情况。结果显示,DZ株基因组10个基因节段分别与来源于牛(VP2、VP7、NSP1、NSP3)、犬(VP3、NSP5)、羔羊(NSP2)、马(VP6)、猕猴(VP1)、人(NSP4)以及人-牛基因重配(VP4)的轮状病毒株。其中VP1基因与猕猴轮状病毒(RRV)的同源性最高,为81.3%,但低于VP1基因分型的临界值83%,因此DZ株的VP1为新出现的基因型,命名为R17;分离株NSP3基因与法国RF株NSP3基因的同源性高达98%,DZ株与RF株的NSP3属于同一基因型,命名为T18型。所以,本研究分离的BRV DZ株的基因型为G6-P5-I2-R17-C2-M2-A3-N2-T18-E2-H5。VP7和VP4基因遗传进化分析结果显示,DZ株VP7基因来源于韩国KJ69-1株,VP4基因来源于美国疫苗株RotaTeq-SC2-9。与同源性最高的病毒株相比,DZ株VP4、VP7蛋白氨基酸序列分别发生了9处和8处突变。这些突变可能会引起VP7和VP4蛋白的抗原性和组织嗜性变化,进而影响病毒的免疫原性、宿主嗜性以及致病性。综上所述,DZ株是多宿主来源的基因重配病毒株,且主要抗原蛋白VP7和VP4发生了较大变异。本研究为我国BRV遗传进化及其分子流行病学和疫苗的研究奠定了实验基础。 相似文献
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为了探讨动物轮状病毒的细胞培养特性和分离方法,建立FQ-PCR检测方法,旨在为研发诊断试剂盒和疫苗莫定基础.37℃5%CO2下用细胞培养液C培养ELISA检测的阳性猪粪便样本,观察细胞形态的变化;用RV感染MA-104细胞,分离纯化病毒,测定VP6基因序列并分析其同源性,在普通PCR和实时定量PCR的基础上,建立FQ-PCR检测方法.结果,MA-104细胞培养的最佳条件为37℃5%CO2 ;接毒后18 h出现细胞膜缩融合、细胞层裂开、细胞核固缩及空泡化等明显的细胞病变(CPE),CPE达到90%时可收毒;分离到1株猪轮状病毒(暂命名为GSPRV01株),得到VP6为1 200 bp,与标准株(AV-55)的同源性为88.50%. 相似文献
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《中国动物传染病学报》2015,(5)
根据NCBI公布的禽内源性反转录病毒ALVE1序列设计引物,以SPF鸡胚制备的成纤维细胞为生物材料,建立了ALVE基因序列分析、甲基化水平和转录表达检测方法。以鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast cell,CEF)和巨噬细胞系(HD11)两种细胞的基因组为模板,通过常规PCR扩增获得了1912 bp的扩增产物,测序后与内源性ALVE1序列比对,核苷酸同源性高达98%以上,说明扩增产物为内源性病毒序列。同时,利用焦磷酸测序分析LTR片段甲基化水平,结果显示,LTR在非免疫细胞CEF中的甲基化水平显著高于巨噬细胞系HD11。利用常规RT-PCR和荧光定量PCR在两种细胞均检测到禽内源性反转录病毒LTR基因、gag基因、pol基因和env基因的转录表达。本研究为今后分析禽内源性反转录病毒ALVE功能提供了方法,同时也为深入研究禽内源性反转录病毒ALVE表观遗传学调控机制奠定了基础。 相似文献
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通过反转录-聚合酶链反应(RT～PCR)扩增了猪轮状病毒国内地方分离株JL94的VP6基因cDNA片段。将其插入克隆载体质粒pMD18-T 的EcoRV酶切位点处，构建了重组质粒pMD18-T—VP6。对克隆的VP6基因进行序列测定，测序结果显示VP基因全长1356bp，并与猪A群轮状病毒OSU(亚组Ⅰ),Gottfried(亚组Ⅰ)的VP6进行同源性比较，结果显示，核苷酸序列同源性分别为86．85％、82．41％，氨基酸序列同源性分别为97．48％、93．20％，结果表明JL94分离株与OSU株在基因型上更为接近。 相似文献
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禽流感病毒HA基因的分子克隆和测序 总被引：14，自引：0，他引：14
血凝素（HA）是禽流感病毒诱导机体产生保护性体液免疫反应的主要靶抗原。本研究的目的是克隆HA基因，为以后的表达及基因工程疫苗的研制奠定基础。收获接毒鸡胚的尿囊液，超速离心沉淀病毒，采用异硫氰酸胍法提取病毒RNA，利用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）技术扩增出禽流感病毒（H9N2亚型）血凝素的cDNA。PCR产物加A尾后，用玻璃奶试剂盒回收纯化目的片段，通过T－A连接将加尾PCR产物连接到线状克隆载体pGEM-T easy vector，转化DH5α感受态细胞，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，经酶切鉴定，对目的片段进行测序，结果获得了HA基因全长，约1．7kb，与已知序列进行同源性比较，同源性最高的可达97％，所克隆的基因为禽流感HA基因工程疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
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鹅细小病毒VP3基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中表达 总被引：2，自引：0，他引：2
根据已发表的鹅细小病毒(GPV)B株核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增GPV吉林分离株主要结构蛋白VP3基因,获得大小为1605bp的核苷酸片段。将该片段纯化后克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌JM109,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。经过酶切和连接反应,将VP3基因克隆入真核表达载体pVAX1,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行了PCR和酶切鉴定。通过脂质体法将pVAX1-VP3转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光法检测。结果显示,VP3基因克隆成功,与GPVB株核苷酸序列同源性为96.2%;PCR和酶切鉴定结果证实,成功构建了含VP3基因的GPV真核表达载体pVAX1-VP3。提取转染该质粒的Vero细胞RNA,RT-PCR扩增,在1000～2000bp可见一明显DNA条带;间接荧光抗体染色转染细胞,在细胞表面可见特异荧光。 相似文献
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参考GenBank中发表的PRV OSU毒株VP7基因核苷酸序列ORF两端保守区序列,设计1对特异引物,以PRV GD1株反转录cDNA为模板,通过PCR方法扩增出长约1 kb的基因片段,并克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。测序结果表明:VP7基因全长1 062 bp,含有一个981 bp的开放阅读框,编码326个氨基酸。与国内外已知的13个毒株VP7全长基因的核苷酸及推导的氨基酸序列比较,相似性分别为77.4%～100%和78.6%～99.7%;核苷酸系统发育进化树结果表明,GD1毒株与轮状病毒A2,JP3-6毒株亲缘关系较近,为一个进化群。 相似文献
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根据已经扩增的鹿流行性出血病病毒(EHDV)VP7基因序列,设计一对扩增VP7基因特异性引物,用RT-PCR从血清I型EHDV(EHDV-1)总RNA中扩增VP7基因,并将其克隆到原核表达载体pBAD/Thio中,构建了重组原核表达质粒pBAD/Thio-EHDV VP7。将表达载体转入大肠埃希菌(E.coliLMG194),用L-阿拉伯糖诱导表达。SDS-PAGE和Western blot试验结果表明,EHDV VP7基因在LMG194中得到了表达,其表达产物可以与EHDV阳性血清特异性反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性。 相似文献
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鸡传染性贫血病毒VP1和VP2基因共表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中收录的鸡传染性贫血病毒(CIAV)基因组序列,设计了扩增CIAV VP1和VP2基因的特异性引物,运用PCR技术从发病鸡肝组织DNA中扩增得到VP1、VP2基因,并将其克隆至pMD18-T载体.核苷酸测序结果显示,其序列与发表的序列同源性达到99.8%.将VP2基因克隆到pMD18-T载体,并对Vp3基因起始密码子进行定点突变,得到突变基因mVP2.将mVP2、VP1先后克隆至pIRES载体,并转化大肠埃希菌JM109,提取质粒通过酶切鉴定显示,成功获得了共表达质粒pIRES-VP1/mVP2. 相似文献
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