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1.
为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组腺病毒活载体疫苗,本研究将PRRSV GP5和M基因串联表达盒定向克隆至穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA多克隆位点处,获得重组穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-GP5-M,与骨架质粒pacAd5 9.2-100共转染293AD细胞,包装出含有GP5和M基因的重组腺病毒rAd5-GP5-M。应用PCR技术、间接免疫荧光、Western blot分析,结果表明,GP5和M基因已经被成功整合到了腺病毒基因组上,且GP5和M蛋白在293AD细胞上均得到了表达;滴度测定表明,该重组腺病毒rAd5v-GP5-M的TCID50为10-6.5/mL;连续传代试验表明该重组腺病毒可在细胞内稳定繁殖,有效地转录并表达GP5和M蛋白,具有较高的遗传稳定性。该研究为PRRSV重组腺病毒疫苗的研制打下了基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2017,(2):254-257
PCR扩增牛源犬新孢子虫NcAMA1基因,克隆至pMD18-T simple载体;将鉴定正确的NcAMA1基因亚克隆至pCR259腺病毒穿梭载体,构建重组腺病毒穿梭质粒pCR259-NcAMA1;依次转化HighQ-1Transpose-AdTM294和HighQ-1TM感受态细胞,构建NcAMA1基因重组腺病毒表达质粒T294-NcAMA1;PacⅠ酶线性化后,脂质体介导转染至QBI-HEK293细胞,包装Ad5-NcAMA1重组腺病毒。结果表明,获得Ad5-NcAMA1重组腺病毒滴度为5.6×109 TCID50/mL;经PCR检测到重组腺病毒NcAMA1基因;经IFAT和Western blot检测NcAMA1基因在QBIHEK293细胞中获得表达,表达蛋白相对分子质量为68 000,具有较好的反应原性。本试验成功构建了Ad5-NcAMA1重组腺病毒,为牛源犬新孢子虫NcAMA1基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定基础。 相似文献
3.
表达猪瘟病毒石门株E0抗原的重组腺病毒构建及免疫性的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
应用PCR从pMD18-T-E0质粒中扩增编码CSFV E0蛋白的基因片段,定向克隆到重组腺病毒Adeasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带CSFV E0基因的重组腺病毒基因组质粒pAdEasy-E0,转染293细胞,成功包装出重组腺病毒pAd-E0,PCR证实E0基因已整合至腺病毒基因组中,用Western blot检测到重组病毒感染293细胞中E0蛋白的表达。重组病毒免疫小鼠和猪,结果2次免疫后产生明显的免疫应答,ELISA检测小鼠血清抗体滴度分别为1∶512和1∶10240;猪血清抗体滴度分别为1∶16和1∶64。本研究成功构建了表达猪瘟病毒E0基因的非复制型重组腺病毒,该重组病毒免疫小鼠可产生较高的抗体滴度,免疫猪后能提供一定的保护效果。 相似文献
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为构建产肠毒素大肠埃希菌(ETEC) STa-K99融合蛋白重组腺病毒载体Ad STa-K99,通过PCR技术分别克隆了STa及K99基因,并与腺病毒穿梭质粒连接构建了穿梭质粒pAd5 STa-K99,将pAd5STa-K99和骨架质粒(含GFP基因)分别用Pac Ⅰ酶切线性化,利用LipofectamineTM LTX&-PLUS共转染293细胞进行同源重组包装重组腺病毒,通过PCR及Western blot对重组腺病毒进行鉴定.结果显示,重组腺病毒Ad5 STa-K99构建正确并表达融合蛋白,且表达的融合蛋白能够被抗体所识别,为研制由ETEC引起的新生动物腹泻重组腺病毒载体疫苗奠定了基础. 相似文献
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表达牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒的构建及免疫原性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒,并分析其免疫原性,PCR扩增牛源犬新孢子虫NcSRS2基因,构建克隆质粒pMD18-T-NcSRS2、重组腺病毒穿梭质粒pCR259-NcSRS2及表达质粒Transpose-AdNcSRS2,脂质体介导转染QBI-HEK293细胞,包装重组腺病毒Ad5-NcSRS2,PCR检测重组腺病毒NcSRS2基因,IFAT和Western blotting检测NcSRS2基因在QBI-HEK293细胞中的表达,测定病毒滴度后,收集病毒液免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测小鼠血清IgG抗体水平.结果显示,扩增的牛源犬新孢子虫NcSRS2基因大小为1 227 bp,与GenBank中发表的NcSRS2( AF061249)核苷酸序列相似性为99％;重组腺病毒Ad5-NcSRS2在293细胞中包装成功,表达蛋白的相对分子质量为43 ku,具有较好的反应原性;测得重组腺病毒Ad5-NcSRS2滴度为109TCID50·mL-1,间接ELISA检测二免后3周BALB/c小鼠血清中IgG抗体效价达1 ∶ 2 048.本研究成功构建了具有良好免疫原性的重组腺病毒Ad5-NcSRS2,为牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了基础. 相似文献
6.
拟构建表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)QS10株S1蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒,并在本动物上进行初步的免疫学试验。通过RT-PCR获得S1基因,插入腺病毒表达系统穿梭质粒,构建重组穿梭质粒pac-Ad5CMV-S1,转染293AD细胞获得表达S1蛋白的重组腺病毒。PCR检测显示,S1基因已重组到腺病毒基因组;间接免疫荧光和Western blot检测证明该重组病毒在293AD细胞中真实表达了具有免疫反应性的IBV S1糖蛋白。重组病毒培养滴度可达到107 TCID50.mL-1。免疫接种SPF鸡后,通过ELISA检测,免疫鸡产生了针对IBV的特异性抗体。作者成功构建了表达IBV S1蛋白的重组腺病毒,该重组病毒可在SPF鸡体内诱导产生IBV特异性抗体。 相似文献
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【目的】试验旨在以复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体,构建Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型(RHDV2)VP60蛋白的重组腺病毒,为RHDV2新型疫苗研究提供依据。【方法】修饰、合成带有Kozak序列的VP60基因序列,将其与腺病毒穿梭质粒进行重组,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,构建重组腺病毒穿梭质粒,并利用酶切与测序对重组腺病毒穿梭质粒进行鉴定;采用Ad Max腺病毒包装系统,基于HEK293细胞进行穿梭质粒与腺病毒骨架质粒的定点同源重组,构建重组腺病毒Ad5-RHDV2-VP60并感染HEK293细胞,通过RT-PCR、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)对重组腺病毒进行表达验证;利用Reed-Muench方法测定重组腺病毒的病毒滴度。【结果】重组腺病毒穿梭质粒酶切鉴定结果可见2条大小分别为3 895和1 752 bp的条带,测序比对结果显示,其与GenBank中公布的相应序列相似性>99%,表明穿梭质粒构建成功。RT-PCR结果可见大小约为515 bp的特异性条带;Western blotting结果显示,大小约为60 ku的VP60... 相似文献
8.
本研究旨在构建能够表达非洲猪瘟病毒(ASFV)P72蛋白的缺陷型重组腺病毒。参考ASFV China-SY18株的基因序列,合成B646L基因。先将合成的B646L基因通过TOPO连接克隆到过渡载体pENTR/D-TOPO中;再将插入B646L基因的过渡载体pENTR/D-TOPO-ASFV-P72与pAd/CMV/V5-DEST腺病毒骨架载体进行重组,得到pAd-ASFV-P72重组质粒;重组质粒经PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞,连续传代后获得重组腺病毒。结果表明,获得的Ad5-ASFV-P72重组腺病毒的滴度为2.53×10~9 IFU·mL~(-1);经免疫荧光方法及Western blot鉴定ASFV-P72蛋白在Vero细胞中成功表达,且能够与ASFV标准阳性血清发生特异性反应。本研究成功获得能够表达ASFV P72蛋白的重组腺病毒Ad5-ASFV-P72,不仅为ASFV多基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了一定基础,还为ASFV相关血清学诊断方法的建立提供了安全有效的抗原。 相似文献
9.
为构建猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP5双基因共表达重组腺病毒,将扩增的ORF2基因和GP5基因通过IRES元件串联,构建重组腺病毒穿梭质粒.然后用Pme Ⅰ酶切穿梭质粒,使其线性化,将线性化质粒转化pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,同源重组后筛选重组腺病毒质粒,经Pac Ⅰ酶切后转染293A细胞进行包装,获得重组腺病毒.PCR鉴定表明重组腺病毒含有ORF2和GP5基因,Western blot检测结果表明ORF2基因和GP5基因在293A细胞内获得表达.重组腺病毒经293A细胞连续传30代,TCID50稳定为10-9.0/mL.初步动物免疫试验结果表明,该重组腺病毒能够刺激机体分别产生PCV-2和PRRSV的特异性抗体免疫应答反应.该重组腺病毒可以作为PCV-2与PRRSV二联基因工程疫苗研究的候选毒株. 相似文献
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通过细菌内同源重组的方法成功构建了表达H3N2亚型猪流感病毒血凝素的重组腺病毒。首先将血凝素基因亚克隆到穿梭载体质粒pAdeno Vator-CMV5-IRES-GFP上，与腺病毒基因组质粒pAdeno Vator△E1／E3共转化大肠杆菌BJ5183菌株，经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAd—HA—GFP。将该重组质粒转染293细胞以包装重组腺病毒。根据报告基因GFP的表达及Western-blot分析，证明获得了可正确表达猪流感病毒血凝素的重组腺病毒rAd—HA—GFP。重组腺病毒经一次性腹腔注射接种昆明鼠，2周后可检测到血凝抑制抗体，并且抗体至少可以持续12周，证实重组腺病毒介导表达的血凝素蛋白具有良好的免疫原性，可诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体。 相似文献
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以国际标准强毒Ｒ株人工感染非免疫产蛋鸡,定时扑杀,分别从鼻窦、眶下孔、气管、肺、气囊、卵巢和输卵管分离ＭＧ,并收集感染鸡所产蛋分离ＭＧ。结果表明,人工感染４８小时后上、下呼吸道及肺已被全面感染,９６小时气囊已被感染,１２０小时输卵管已能分离到ＭＧ,卵巢始终分离不到ＭＧ。人工感染鸡自１４４小时便能在其所产蛋中分离出ＭＧ。药物治疗能在７２小时内消除感染,油乳剂苗则需２４天后逐渐降低蛋内ＭＧ分离率,药物卵内注射、种蛋药浴、高温处理均能杀死卵内ＭＧ,但以研制的种蛋浸泡剂药浴效果为最好。 相似文献
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魏静 《四川畜牧兽医学院学报》2009,(4):28-32
在现代法律秩序中,商会自治规范是制定法的基础和必要的补充,甚至在某些方面替代了制定法;商会自治规范主要包括商会组织规范、行为规范、惩罚规范以及争端解决规范等;其效力仅及于其内部成员;商会自治规范和制定法之间存在冲突,但也存在整合的基础。 相似文献
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本文概述了猪的毛色类型、猪的毛色遗传模式,着重综述了猪毛色基因分子基础的研究进展,指出存在问题并就未来发展方向做了思考。 相似文献
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REASONS FOR PERFORMING STUDY: Centesis of the bicipital bursa using an 8.9 cm long spinal needle has been reported but the alternative of employing a 3.8 cm long hypodermic needle requires validation. OBJECTIVE: To compare the efficacy of 2 different methods of centesis of the bicipital bursa and to evaluate the usefulness of ultrasonographic imaging to determine the location of solution administered when centesis of the bursa is attempted. METHODS: For Trial 1, 6 clinicians, who had no previous experience of centesis of the bicipital bursa, attempted to inject a solution composed of an aqueous radiopaque contrast medium and physiological saline solution (PSS) into the bicipital bursae of 2/12 horses using the previously described distal approach to inject one bursa and a proximal approach to inject the contralateral bursa. The bicipital tendon and bursa were examined ultrasonographically before and after injection; and both shoulders were examined radiographically to identify the location of the medium. In Trial 2, another 6 clinicians, also with no previous experience of centesis, repeated Trial 1, using 6 horses, but the radiopaque contrast medium was mixed with air instead of PSS. RESULTS: Accuracy of centesis using the proximal approach was 39% and that of the distal approach 28%. Ultrasonographic examination of the shoulder allowed the location of solution and air to be accurately predicted in all 12 shoulders examined. CONCLUSIONS: Clinicians who have had no previous experience performing centesis of the bicipital bursa are unlikely to be successful in centesis using either approach. Radiographic examination after injecting a radiopaque contrast medium may be necessary to assess the success of centesis especially if bursal fluid is not obtained during centesis. Injecting air along with the radiopaque contrast medium provides more accurate ultrasonographic confirmation of centesis and better radiographic definition than does injection without air. 相似文献
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