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1.
采用在线LUXTM专业软件,根据BTV-NS3基因序列和EHDV-NS3基因序列,通过特异性单一引物序列3′末端的荧光标记,分别设计出两对BTV和EHDV的LUX荧光PCR引物,并采用BLAST软件对各引物进行匹配性和特异性分析,根据分析结果选择合适的引物合成。经过各反应条件的优化和特异性、敏感性试验,并对BTV、EHDV、VSV、PPRV、BVDV、AKV的BHK-21细胞培养物和临床样品检测,与常规RT-PCR进行对比检测,建立了能同时鉴别检测BTV和EHDV的二重LUXTM荧光PCR方法。该二重LUXTM荧光PCR的BTV和EHDV各自引物只对相应的病毒呈阳性反应,两者没有交叉反应现象,对健康牛、羊和猪基因组DNA、BKH-21细胞对照,以及其他几种相似疾病如VSV、PPRV、BVDV、AKV均呈阴性反应。该法对病毒的细胞培养液鉴别检测敏感性可达1TCID50C以上,比常规RT-PCR敏感性提高10倍以上,从样品核酸纯化到完成二重LUXTM荧光PCR反应和熔解曲线分析,仅需3h,在进出口动物检验检疫中快速鉴别BTV和EHDV具有实际应用价值。 相似文献
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为实现对山羊痘病毒(GTPV)和小反刍兽疫病毒(PPRV)的同步快速检测,基于GTPV的ITR基因及PPRV的M基因,分别设计合成两套特异性引物及探针;探针分别用5'-FAM-TAMRA-3’及5'-JOE-Eclipse-3'标记物进行标记以实现同步检测.结果显示,所建立的ITR-M二联探针荧光定量RT-PCR方法可同时特异性检测GTPV和PPRV产生特异性荧光信号,而对禽痘病毒、犬瘟热病毒等相关病毒无荧光信号可检出.以GTPV-ITR和PPRV-M的pMD-18T载体质粒为标准品,构建了双重标准曲线,ITR M探针的检测敏感度可分别达103拷贝/μL及101.2拷贝/μL cDNA.本研究初步建立了可同步快速检测GT-PV和PPRV的二联实时荧光定量RT-PCR法. 相似文献
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蓝舌病是一种侵害反刍动物的虫媒传染病,被世界动物卫生组织(Office International des Epizooties,OIE)列为上报疾病,我国将其列为一类动物疫病.本研究利用计算机软件分析获取蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)核酸检测的保守靶序列,设计引物和TaqMan荧光探针,建立了BTV荧光定量RT-PCR技术,进行了特异性、敏感性、重复性等实验评价,并对动物样品进行检验.结果显示,该技术可有效检出不同血清型BTV,与流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)无交叉反应;对RNA标准品的检测灵敏度为102 copies;重复检测CV<5%,可对动物样品进行有效检测.因此,所建立的BTV TaqMan/荧光定量RT-PCR技术可为蓝舌病诊断提供一种快速、可靠的病原检测手段. 相似文献
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小反刍兽疫疫苗毒株与强毒株的鉴别性荧光RT-PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行分析,设计引物与探针,建立PPRV通用型与Ⅱ系疫苗毒特异型二重实时荧光RT-PCR方法,同时建立针对PPRVIV系强毒株的特异型荧光PCR方法。特异性试验和灵敏度试验表明：建立的二重荧光RT-PCR方法可特异性检测PPRV病毒,其HEX信号通道（通用型）和TAMRA信号通道（Ⅱ系疫苗毒特异型）的检测灵敏度分别可达10^1 TCID50/mL和10^2 TCID50／mL,完全满足PPRV的检测要求。用二重荧光RT-PCR方法对西藏采集的14份羊血清样品进行检测,并用建立的Ⅳ系强毒株特异型荧光PCR方法对二重荧光RT-PCR的检测效果进行评估,结果显示,该方法可有效甄别PPRV强毒株和疫苗毒株,避免假阳性结果的出现。 相似文献
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蓝舌病毒群特异性RT—PCR检测技术及其应用 总被引：1，自引：1，他引：0
目的:建立一种适于蓝舌病毒(BTV)群特异性基因检测的RT-PCR方法。方法:根据本实验室设计的一对BTVNS1基因通用型检测引物建立BTV群特异性RT-PCR检测技术;对不同血清型BTV及鹿流行性出血热病毒(EHDV)进行检测,验证其特异性;同时,利用该方法检测血清模拟样品及抗病毒血清样品。结果:所设计的检测方法特异性好,与EHDV无交叉反应,可检测至少17个血清型BTV,并能有效检出不同病毒浓度的模拟样品及不同型的血清样品。结论:建立的RT-PCR方法可用于BTV群的特异性通用检测。 相似文献
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我国首例小反刍兽疫诊断报告 总被引：30，自引：10，他引：30
2007年7月我国西藏发生不明山羊疫情,国家外来动物病诊断中心对当地动物疫病控制中心送检的14只病死山羊病料和一批血清样品分别进行病原学和血清学检测。利用较敏感的小反刍兽疫病毒(PPRV)特异性荧光定量RT-PCR方法,在11只病羊组织中检测到小反刍兽疫病毒核酸。利用次敏感的PPRV普通RT-PCR方法,从8只病羊组织中检测到PPRV核酸。针对1号样本病原核酸N基因和F基因片段进行遗传发生分析,该病原属于4系。利用竞争ELISA试剂盒对送检的13份血清样本进行抗体检测,结果全部阳性。将1号组织样本接种Vero细胞分离病毒,透射电镜观察下,发现了500纳米左右的病毒粒子。对分离毒株进行PCR检测同样证实其为PPRV。 相似文献
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为建立一种快速、敏感和特异地鉴别尼帕病毒(NiV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的检测方法,本试验以NiV M基因和HP-PRRSV nsp2基因为靶序列,通过优化反应条件建立了一种二重荧光RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、定量线性范围、敏感性和重复性进行了评价及初步应用.结果显示,用该方法检测NiV M基因和HP-PRRSV nsp2基因的RNA标准对照(NiV-M-RNA和HP-PRRSV-nsp2-RNA),线性范围分别为4.6×101~4.6×107和4.1×101~4.1×108拷贝/μL;最低检出限分别为46和4.1拷贝;该方法组内试验和组间试验的变异系数均小于2.0%,显示出良好的可重复性;该方法仅对NiV和HP-PRRSV呈现特异性扩增曲线,不与猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪流感病毒(SIV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)发生交叉反应.用该方法对236份猪实际样品进行NiV和HP-PRRSV核酸检测,所有样本的NiV检测结果均为阴性,8份样本的HP-PRRSV检测结果为阳性.本研究建立的方法为猪实际样本中NiV和HP-PRRSV的鉴别检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段. 相似文献
9.
利用鹿流行性出血病（EHD）病毒核酸的保守靶序列（VP7）,设计引物和TaqMan荧光探针,建立了EHDV荧光定量RT-PCR技术,并进行了特异性、敏感性、重复性等实验评价。结果显示,该技术可有效检出EHD-1、EHD-2、EHD-4、EHD-7型病毒,与蓝舌病病毒（BTV）等病毒无交叉反应;对阳性模板（重组质粒）的检测灵敏度为1个copies;重复检测CV〈5%。因此,所建立的EHDV TaqMan/荧光定量RT-PCR方法可为鹿流行性出血病病毒检测提供一种快速、可靠的病原检测手段。 相似文献
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为建立小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)可视化快速检测方法,本研究根据PPRV N基因的保守序列设计、合成和筛选出反转录重组聚合酶介导恒温扩增(RT-RAA)特异性引物和CRISPR/Cas12a特异性crRNA。结合侧向流试纸,本研究建立了一种PPRV RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化快速检测方法,并对该方法的性能进行了评估。结果显示,该方法特异性良好,与蓝舌病毒(BTV)、鹿流行性出血热病毒(EHDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、羊痘病毒(CaPV)、猪水泡病病毒(SVDV)、伪狂犬病毒(PRV)等病毒核酸无交叉反应;敏感性高,最低可检出4.30×101拷贝/μL的PPRV核酸;应用该方法及国家标准推荐的RT-qPCR方法对60个模拟样品进行平行检测,结果显示Kappa值为0.918,表明两者具有高度一致性。综上表明,本研究建立的PPRV RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化快速检测方法特异性好、敏感性高,且操作简单、无需特殊仪器,可应用于野外或基层农场的PPRV快速筛查检测工作... 相似文献
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4种动物虫媒病病毒多重RT-PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
分别设计和合成4对特异性引物,通过对反应条件的优化,初步建立了鉴别蓝舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血病病毒(EHDV)、水疱性口炎病毒(VSV)和赤羽病病毒(AKV)的多重RT-PCR检测方法,并对其特异性和敏感性进行了检测。结果表明,所设计的4对引物可对同一样品中的VSV、BTV、EHDV和AKV进行特异性扩增,所扩增的目的片段的长度分别为301、351、537、250bp。建立的四重RT-PCR检测方法能够检测出10-7稀释的细胞培养病毒液,4种病毒之间没有发生交叉反应,说明该检测方法特异性强,敏感性较高。所建立的多重RT-PCR方法可用于上述4种动物虫媒病病毒的快速鉴别诊断,在动物检疫、临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。 相似文献
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实时荧光定量RT-PCR检测牛库布病毒 总被引：1，自引：1，他引：0
牛库布病毒（bovine kobuvirus，BKoV）可能是一个腹泻相关病原，目前还没有检测该病毒的实时荧光定量RT-PCR方法的报道。依据BKoV 3D核苷酸序列，采用Primer 6.0设计了一对引物，通过优化反应条件和反应体系，成功建立了检测BKoV的TB Green染料法实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示此方法在4.86×108~4.86×102 copies·μL-1病毒浓度之间具有良好的线性关系，相关系数为0.999 5，扩增效率为92.75%；此方法只特异性检测BKoV，而与其他常见的腹泻病原没有交叉反应；组内及组间的变异系数均小于2%；最低检测下限为4.86×102 copies·μL-1。本研究所建的实时荧光定量RT-PCR方法对奶牛和牦牛腹泻粪便样本中BKoV的检出率明显高于已报道的3篇有关RT-PCR方法。对2018年5月-2019年5月采集自青藏高原地区（青海、西藏和四川藏区）的131份牦牛腹泻粪便样本进行检测，结果显示BKoV检出率为31.30%。首次成功建立了检测BKoV的实时荧光定量RT-PCR方法，具有良好的特异性和稳定性，且灵敏度高，为BKoV的检测及流行病学调查提供了一种新的技术手段；并且首次证实BKoV在牦牛中的流行，为牦牛腹泻的防控问题提供了参考。 相似文献
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为建立敏感、特异的评价猪瘟兔化弱毒(HCLV)疫苗中病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法,参照中国猪瘟石门株兔化弱毒全长序列,在猪瘟兔化弱毒活疫苗基因组5'非编码区设计1对标准品引物、1对特异性引物和1条探针,建立检测猪瘟兔化弱毒活疫苗病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法.该方法检测的敏感度达1.20×105拷贝/mL;对猪繁殖与呼吸综合征、猪乙型脑炎、仔猪副伤寒和猪伪狂犬病4种活疫苗基因组扩增结果均为阴性;重复性试验结果显示,批内变异系数为0.29%～0.39%,批间变异系数为0.32%～0.61%.应用此方法对6个不同厂家生产的7种猪瘟兔化弱毒活疫苗中病毒含量进行了检测,发现不同厂家生产的疫苗中病毒含量存在较大差异.结果表明,建立的猪瘟兔化弱毒疫苗实时荧光定量RT-PCR方法能特异地检测疫苗病毒含量,可用于初步评价猪瘟兔化弱毒疫苗抗原含量. 相似文献
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为了建立一种快速、特异、灵敏的检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Taq Man实时荧光定量RT-PCR的方法,根据NCBI GenBank上已公布的BVDV、猪瘟病毒(CSFV)核酸序列进行比对,利用Oligo 6.71软件设计一对引物及一条探针,建立了检测BVDV的Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法。通过对该方法的特异性、重复性及其敏感性进行相关试验,结果表明该方法检测出BVDV标准毒株Oregon C_(24)V为阳性,猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和CSFV的检测均为阴性。对BVDV标准毒株最低检测量达到10~(-2.5) TCID_(50)。该方法检测同一样品重复进行8次检测,结果均一致,表明方法的重复性较好。应用该方法对6批猪瘟疫苗专用血清进行BVDV检测,阳性率为16.7%;猪瘟弱毒苗中未检出BVDV。建立的BVDV Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法为生产无BVDV污染的猪瘟苗提供了有力的保障。 相似文献
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为探索建立马病病毒基因芯片检测方法,采用人工拼接的方式拼接了非洲马瘟病毒(ASHV)核酸序列,通过分子克隆技术获得西尼罗病毒(WNV)和马冠状病毒(ECV)的特异基因片段。用芯片点样仪逐点分配到处理过的玻片上,制备成检测芯片。以拼接、克隆的核酸序列为模板通过多重不对称RT-PCR进行特异性扩增和荧光标记后滴加到芯片上进行杂交,对杂交结果进行扫描检测和计算机软件分析。结果显示,制备的基因芯片可同时检测和鉴别上述3种病毒,ECV质粒样品、WNV质粒样品检测灵敏度为102拷贝;AHSV质粒样品检测灵敏度为104拷贝。其他病毒材料未出现荧光信号,验证了本方法的特异性。证明基因芯片技术可快速、准确和灵敏地同时进行多种病毒的检测。 相似文献
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《中国兽医学报》2019,(12):2298-2304
为了建立一种快速、敏感、特异的能够鉴别诊断口蹄疫病毒(FMDV)和塞内卡病毒(SVV)二重实时荧光RT-PCR方法,根据FMDV及SVV的保守基因序列,设计了2套特异性引物和不同荧光素标记的MGB探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了FMDV和SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,并对二重实时荧光RT-PCR检测方法进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对98份疑似FMDV和SVV感染的临床样品进行了检测。结果显示,成功建立的FMDV及SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,模板在10~1～10~7拷贝/μL有很好的线性关系;对pGEM-T/FMDV和pGEM-T/SVV重组质粒出现阳性扩增信号,但对正常细胞培养物对照和其他7种病原对照未扩增出特异性曲线,方法特异性较好;最低检测模板浓度为10拷贝/μL;自98份疑似FMDV和SVV感染样品中检出9份FMDV阳性,10份SVV阳性,2份FMDV和SVV双阳性,并且和克隆测序结果一致。本研究建立的FMDV及SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,可用于FMDV和SVV的快速鉴别检测,为FMDV和SVV的鉴别诊断提供特异、敏感和高通量的方法。 相似文献
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本研究根据非洲马瘟病毒（AHSV）S7基因保守序列设计特异性引物和探针,建立了检测AHSV的实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增（RT-RPA）方法。该方法特异性强,仅AHSV检测为阳性,蓝舌病病毒（BTV）、马流感病毒（EIV）、马动脉炎病毒（EAV）等病原检测均为阴性;灵敏性高,最低检出限为2.36×101 copies/μL;反应快速,检测时间为20 min,同时具有良好的重复性。利用该方法和实时荧光RT-PCR平行检测60份临床样品,符合率为100%。结果表明,本研究建立的AHSV RT-RPA检测方法特异、敏感、快速且结果可靠,适用于AHSV的高通量、快速检测。 相似文献
18.
《中国预防兽医学报》2017,(10)
为制备蓝舌病病毒(BTV)NS3基因标准样品并建立BTV通用型荧光定量RT-PCR检测方法,本研究首先从BTV-1型核酸中扩增完整的NS3基因,经克隆测序后,采用体外转录方法制备其cRNA。使用RNA保存液稀释至含量约10~8拷贝/μL,分装后进行均匀度和稳定性检验,并通过联合定值确定标准样品的量值。结果表明,BTV NS3标准样品的瓶间差异5%,均匀度和稳定性良好;定值结果为(1.032±0.02)×10~8拷贝/μL。此外,使用该BTV标准样品作为模板,通过优化反应体系和条件,建立了BTV通用型荧光定量RT-PCR快速检测方法,并评价其特异性和敏感性。结果显示,该方法能够对目前流行的26个血清型的BTV核酸检测均为阳性,而与其它相关的反刍动物病毒均无交叉反应,特异性良好,且最低可检测到10拷贝/μL病毒核酸。采用建立的BTV荧光定量RT-PCR方法对送检的临床样品进行检测,并与国家标准规定的套式RT-PCR方法进行比较,结果表明两种方法一致性很高,但荧光定量RT-PCR方法操作更为简便,结果准确,更适用于大量临床样品的检测。 相似文献
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根据基因库中鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的基因序列,设计2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针.对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能够同时检测鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量RT-PCR方法.该方法敏感性好,对鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的检测敏感性均达到200个模板拷贝数;该方法特异性强,对鸭圆环病毒、鹅细小病毒、鸭副黏病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等病原体的检测全为阴性.本研究建立的鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点,可用于临床上鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒感染的检测. 相似文献
20.
《云南畜牧兽医》2020,(3)
建立西藏环状病毒(Tibet orbivirus, TIBOV)RT-PCR诊断方法。根据云南省新分离到的TIBOV Seg-7片段序列设计1套巢式引物为120S7F1/R1、120S7F2/R2。以TIBOV DH13C120株病毒核酸为模板,优化反应条件,建立巢式RT-PCR检测方法,并对云南省新分离的9株TIBOV进行核酸检测。分别采用外引物(120S7F1/R1)和内引物(120S7F2/R2)对TIBOV DH13C120株进行RT-PCR扩增,退火温度分别为52℃和54℃,外引物扩增出片段大小为1 050 bp条带;内引物扩增出的片段大小为500bp,扩增条带大小与设计预期相一致。而蓝舌病毒(BTV)JCC12-7株和阴性对照两轮扩增均为阴性,采用该方法对云南省新分离的9株TIBOV、2株BTV和1株鹿流行性出血热病毒(EHDV)进行检测,9株TIBOV扩增均为阳性,而BTV、EHDV和阴性对照均为阴性。建立了TIBOV巢式RT-PCR检测方法,该方法可用于云南省目前动物或媒介中流行的TIBOV核酸检测。 相似文献