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试验旨在研究抗菌肽Temprine-La（S）（T-La（S））、Temprine-La（FS）（T-La（FS））、RGD-T-La（S）和RGD-T-La（FS）对2型猪链球菌（SS2）生物被膜形成的抑制作用。通过结晶紫染色法（CV）检测SS2生物被膜形成能力；微量稀释法测定抗菌肽对SS2生物被膜的最小生物被膜抑菌浓度（MBIC）和最小生物被膜杀菌浓度（MBEC）；结晶紫染色法和扫描电镜（SEM）检测抗菌肽对SS2生物被膜形成的影响；XTT法检测抗菌肽对SS2生物被膜代谢活性的影响；苯酚硫酸法检测抗菌肽对SS2生物被膜胞外多糖含量的影响；建立猪链球菌-斑马鱼感染模型，HE染色法观察T-La（FS）对斑马鱼脑组织病理变化的影响；实时荧光定量PCR法分析抗菌肽对SS2生物被膜相关基因及对斑马鱼炎性细胞因子基因转录水平的影响。结果显示，SS2具有良好的生物被膜形成能力；T-La（S）、RGD-T-La（S）、T-La（FS）和RGD-T-La（FS）对SS2生物被膜的MBIC分别为31.3、15.6、7.8和15.6 μg/mL；MBEC分别为62.6、31.2、15.6和31.2 μg/mL；结晶紫染色结果表明，抗菌肽对SS2生物被膜的形成有抑制作用；扫描电镜结果显示，抗菌肽使SS2生物被膜中的细菌数量和生物被膜的形态发生明显变化，细胞外基质大量减少；XTT法结果显示，抗菌肽可显著降低SS2生物被膜的代谢活性；苯酚硫酸法结果显示，抗菌肽能有效抑制SS2生物被膜合成胞外多糖；实时荧光定量PCR结果表明，抗菌肽作用后降低了SS2生物被膜基因的转录水平；T-La（FS）作用后TLR2、MyD88及促炎性细胞因子基因的转录水平显著或极显著降低（P<0.05；P<0.01），抗炎性细胞因子基因的转录水平显著或极显著升高（P<0.05；P<0.01）。抗菌肽主要通过影响生物被膜相关基因转录水平和阻断胞外多糖的合成与分泌来抑制SS2生物被膜的形成，其中T-La（FS）可能通过抑制TLR2信号通路中TLR2和MyD88分子表达，抑制炎性细胞因子的释放，减轻脑膜炎的炎性反应。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2019,(9)
为研究新合成的靶向抗肿瘤肽RGD-T-La(S)、RGD-T-La(FS)对小鼠黑色素瘤B16细胞增殖及其黑色素合成的影响,本研究将T-La (S)、T-La (FS)与RGD (精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸)小分子蛋白质偶联,合成新的靶向抗肿瘤肽RGD-T-La (S)、RGD-T-La (FS)。通过CCK8法检测多肽对B16细胞增殖的影响;微量酶标法检测多肽作用于B16细胞后乳酸脱氢酶(LDH)含量变化;透射电镜观察多肽作用B16细胞后的超微结构;流式细胞仪检测多肽对B16细胞周期的影响;NaOH裂解法和L-Dopa氧化法分析多肽对黑色素合成含量和酪氨酸酶活性的影响;荧光定量PCR (q-PCR)法分析多肽对黑色素合成关键因子酪氨酸酶(TYR)和小眼相关转录因子(MITF)基因转录水平的影响。结果显示,RGD-T-La(S)、RGD-T-La (FS)在10μg/mL时能够显著抑制B16细胞的增殖,且呈现时间浓度依赖性;RGD嵌合体肽在20μg/mL时能够显著增加B16细胞中LDH含量,且呈现浓度依赖性;透射电镜结果显示RGD嵌合体肽作用B16后,细胞出现自噬体及线粒体自噬现象;同时RGD嵌合体肽对酪氨酸酶活性和细胞黑色素蛋白的生成具有明显的抑制作用,显著降低TYR和MITF基因的转录水平。上述结果表明,RGD嵌合体肽在体外具有诱导细胞凋亡,抑制B16细胞增殖的作用,能够促进抗肿瘤肽T-La (FS)对肿瘤细胞的靶向杀伤作用。本实验为研究RGD嵌合体肽RGD-T-La (S)和RGD-T-La (FS)靶向抗肿瘤的作用机制以及为临床相关抗肿瘤药物的研发提供科学依据。 相似文献
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新牛蛙抗肿瘤肽RGD-T-La(FS)嵌合体的设计及其抗肿瘤作用 总被引：1，自引：0，他引：1
为了研究新牛蛙抗肿瘤肽RGD-嵌合体的抗肿瘤作用及其对肿瘤细胞的作用机制。本研究以新牛蛙抗菌肽Temporin-La(T-La)为基序,通过生物信息学分析,改变特定氨基酸残基设计合成新的抗肿瘤肽Temporin-La(S)(TLa(S))和Temporin-La(FS)(T-La(FS)),氨基端偶联RGD肽成RGD-T-La、RGD-T-La(S)和RGD-T-La(FS)抗肿瘤肽,通过圆二色谱检测多肽二级结构,MTT法体外筛选抗肿瘤细胞活性多肽。使用流式细胞仪测定不同肿瘤细胞对不同多肽的吸收量,筛选对抗肿瘤肽敏感的肿瘤细胞。利用激光共聚焦显微镜实时观察抗肿瘤活性强的抗肿瘤肽对敏感肿瘤细胞的杀伤作用,并用扫描电镜观察抗肿瘤肽及其RGD嵌合体肽对肿瘤细胞的作用机制。在新牛蛙抗菌肽Temporin-La基序上设计T-La(S)和T-La(FS)2种抗肿瘤活性肽,圆二色谱仪测定其二级结构均呈α螺旋型,MTT结果显示黑色素瘤细胞(B16)对几种多肽的敏感性最强,10 mg/L质量浓度时,RGD-T-La(FS)对B16的毒性作用最强,细胞存活率为24.65%。激光共聚焦显微镜实时观察到,RGD-La(FS)和RGD-La(S)对肿瘤细胞都有较强的杀伤作用。扫描电镜结果显示,RGD嵌合体多肽对肿瘤细胞的杀伤作用具有位点靶向性。流式细胞仪检测HepG2对FITC-RGD-T-La(FS)的吸收量最大,检测到荧光强度为800 950.70。经改造的多肽T-La(FS)可以增加其对肿瘤细胞的杀伤作用,且偶联RGD的嵌合体RGD-T-La(FS)对肿瘤细胞的杀伤作用更具有靶向专一性,为抗肿瘤肽作为抗肿瘤药物的临床应用提供科学依据。 相似文献
4.
《畜牧与兽医》2021,(9)
旨在研究利福昔明(RIF)与3种精油,即桉叶油(EEO)、薄荷油(MEO)、鱼腥草油(HEO)对奶牛乳房炎源大肠杆菌的抑杀作用和对生物被膜的阻抑效果。自患乳房炎奶牛乳汁中分离47株大肠杆菌,微量肉汤稀释法测定RIF、精油对菌株的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),棋盘法测定RIF与精油的联合抑菌指数(FICI)。结晶紫染色法检测生物被膜形成量,评价菌株形成生物被膜的能力,测定RIF、精油的最小抑膜浓度(MBIC),考察二者抑制被膜形成和消除预制被膜的效果。结果:RIF、EEO、MEO和HEO对大肠杆菌的MIC_(90)分别为32μg/mL、2.5%、0.31%和0.63%。RIF与精油联合对多数菌株表现相加作用,其中RIF+EEO对80%的菌株表现相加作用。RIF、精油对84%以上菌株的MBIC/MIC为1～4,其中EEO对74%以上菌株该比值为1～2。1/2 MIC RIF或1/2 MIC EEO处理可使5株强成膜株的生物被膜形成率最低降至43.8%和5.8%,使其中4株菌的预制被膜留存率最低降至56.6%和44.8%。与RIF、EEO单独处理相比,1/2 MIC RIF+1/4 MIC～1/2 MIC EEO处理后5株强成膜菌被膜形成率和预制被膜留存率均显著降低(P0.05)。RIF和3种精油对乳房炎源大肠杆菌均有较好的抗菌和抗生物被膜作用,二者联合作用更强,且以RIF+EEO的效果最优。 相似文献
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鸡白痢沙门菌和金黄色葡萄球菌是危害家禽养殖业和公共卫生的重要病原菌,生物被膜的形成是其持续和反复感染的重要原因。为探究没食子酸对二者生物被膜形成的影响,本研究采用微量稀释法测定没食子酸对鸡白痢沙门菌CVCC519和金黄色葡萄球菌ATCC 25923的最小抑菌浓度MIC、最小杀菌浓度MBC,共孵育测定最小生物被膜抑制浓度(MBIC)和最小生物被膜清除浓度(MBEC);采用结晶紫染色和硫酸-苯酚法分别测定其对试验菌生物被膜及胞外多糖(EPS)的抑制率,并利用环境扫描电镜观察生物被膜形态;最后采用qRT-PCR方法检测其对试验菌生物被膜形成相关基因表达量的影响。结果显示,没食子酸对CVCC519和ATCC 25923的MIC分别为4 mg/mL和8 mg/mL,MBC分别为8 mg/mL和16 mg/mL,MBIC均为8 mg/mL,MBEC均为16 mg/mL。此外,没食子酸在不显著影响试验菌生长的浓度下,能有效抑制其生物被膜形成和EPS的产生。环境扫描电镜观察发现,没食子酸处理使生物被膜生成量显著减少,结构松散、变薄。qRT-PCR检测结果显示,没食子酸在不显著影响试验菌生长的浓度下,能... 相似文献
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为了研究鱼腥草素钠对金黄色葡萄球菌(S.aureus)生物被膜的抑制活性,试验采用微量稀释法考察了鱼腥草素钠对S.aureus浮游菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),用琼脂平板法测定了其对生物被膜的最小抑膜浓度(MBIC)和最小杀膜浓度(MBBC);通过激光共聚焦显微镜考察了鱼腥草素钠对生物被膜的清除能力;通过Western-blot考察了鱼腥草素钠对S.aureus毒力因子分泌的影响。结果表明:鱼腥草素钠对浮游菌有很好的抑制作用(MIC、MBC:16~64μg/mL),对成熟的生物被膜没有明显的抑制作用(MBIC、MBBC1 024μg/mL),但其亚抑菌浓度在生物被膜形成早期有显著抑制作用,并呈剂量依赖抑制α-溶血素、肠毒素A和肠毒素B的分泌。说明鱼腥草素钠对金黄色葡萄球菌浮游菌和早期生物被膜有较好抑制活性。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2020,(5)
为探究亚抑菌浓度(Sub-MIC)强力霉素或庆大霉素对猪链球菌(SS)生物被膜形成能力和毒力因子表达的影响,本研究采用96孔板法测定强力霉素或庆大霉素对SS的最小抑菌浓度(MIC)。利用结晶紫染色和活细胞计数法分别测定亚抑菌浓度(1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC和1/16 MIC)的强力霉素或庆大霉素作用下SS生物被膜形成能力、SS生长能力及其被膜内SS活菌数量;采用革兰染色观察亚抑菌浓度强力霉素(1/4 MIC和1/8 MIC)或(1/2 MIC和1/4 MIC)庆大霉素作用下SS分布情况;采用qRT-PCR检测亚抑菌浓度(1/4 MIC和1/8 MIC)作用下的SS毒力因子转录水平。结果显示:亚抑菌浓度强力霉素(1/2 MIC～1/16 MIC)或庆大霉素(1/2 MIC和1/4 MIC)均能够增强SS生物被膜形成能力(p0.001)和增加被膜内SS活菌数量(p0.001),且SS具有明显集聚成团现象;不同亚抑菌浓度强力霉素和庆大霉素均减缓了SS的早期生长速率,但随着培养时间延长,其生长特性恢复;1/4 MIC和1/8 MIC的强力霉素或庆大霉素均能够显著降低SS毒力因子cps、ef、sly、fbps、gdh和gapdh mRNA的转录水平(p0.01)。结果表明:亚抑菌浓度的强力霉素和庆大霉素均可以增强SS生物被膜形成能力并降低其毒力因子的转录水平从而形成持续性感染,本研究为抗生素在治疗或预防相关疾病中的正确应用提供参考依据。 相似文献
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《现代畜牧兽医》2021,(9)
试验以55株乳源金黄色葡萄球菌为研究对象,通过结晶紫染色法分析其生物被膜形成能力,应用PCR技术检测乳源金黄色葡萄球菌的所携带的耐药基因和生物被膜形成相关基因。结果表明,55株金黄色葡萄球菌中34株生物被膜形成能力较强,17株生物被膜形成能力较弱,4株无生物被膜形成能力;55株细菌中17株(31%)携带mec A耐药基因,17株金黄色葡萄球菌分为9个ST型,均属于已发现的ST型,其中ST97和ST398为优势株。上述来源相近的金黄色葡萄球菌分型后,基本位于ST97和ST98两个大簇,说明该地区引起奶牛乳房炎的细菌型别相对较集中。生物被膜相关基因Ica A、Ica D、Ica R、Eno、Atl、aap、Bap和sig B基因的检出率分别为44%、36%、27%、89%、60%、42%、18%和25%。研究表明,乳源金黄色葡萄球菌的生物被膜形成能力较强,生物被膜形成能力较强的菌株均携带多个生物被膜形成相关基因,说明生物被膜的形成过程可能是受多个基因共同调节。 相似文献
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穿心莲内酯影响猪链球菌生物被膜形成 总被引：1，自引：0，他引：1
旨在探究穿心莲内酯对猪链球菌生物被膜形成的抑制作用,为猪链球菌病的耐药性提供替代疗法。试验采用微量稀释法测定穿心莲内酯对猪链球菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC);利用结晶紫染色(CV)和扫描电镜(SEM)检测穿心莲内酯对猪链球菌生物被膜形成的影响。结果表明:1)穿心莲内酯对猪链球菌的MIC和MBC分别为0.25和0.5mg·mL~(-1);2)扫描电镜观察可见阴性对照组细菌镶嵌于生物被膜中,而穿心莲内酯在亚抑菌浓度下(1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC)能使细菌生物被膜中的细菌数量和生物被膜形成量均减少,并呈剂量依赖性;3)luxS基因和毒力基因的RT-PCR检测显示亚抑菌浓度(1/2MIC、1/4MIC)的穿心莲内酯明显降低gapdh、sly、fbps、ef和luxS基因的转录,显著增加cps2J、mrp和gdh基因的转录;4)哈维氏弧菌生物发光法测定细菌培养液显示穿心莲内酯在亚抑菌浓度下(1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC)对猪链球菌AI-2信号分子的产生有抑制作用,呈剂量依赖性。穿心莲内酯亚抑菌浓度的干预可抑制猪链球菌生物被膜的形成,并且可致毒力基因表达水平差异。 相似文献
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Extended antimicrobial susceptibility assay for Staphylococcus aureus isolates from bovine mastitis growing in biofilms 总被引：1，自引：0，他引：1
Staphylococcus aureus is one of the most prevalent causes of bovine mastitis. The antimicrobial treatment of this disease is currently based on antimicrobial susceptibility tests according to CLSI standards. However, various studies have shown that there is a discrepancy between the results of this standard susceptibility test and the actual cure rate of the applied antimicrobial treatment. Increasing evidence suggests that biofilm formation by S. aureus is associated with this problem. The currently available antimicrobial susceptibility assays for bacteria growing in biofilms, are not considered reliable enough for routine application. Therefore, the objective of this study was to further develop a susceptibility test for bacteria growing in biofilm, suitable for routine testing of the antimicrobial susceptibility of S. aureus. With the expansion of the available MBEC assay to an extended biofilm susceptibility test, that comprises 2 and 4 consecutive days of antimicrobial challenge, the antimicrobial susceptibility for S. aureus growing in biofilm was further analysed. The results showed clear differences between strains and various antimicrobial agents with respect to the effect of longer duration of the antimicrobial challenge on the eradication of S. aureus growing in biofilm. The extended biofilm susceptibility test also indicates that each bacterial strain requires a specific duration of antimicrobial therapy, which cannot be derived from a standard susceptibility test or from a 24-h biofilm susceptibility test. 相似文献
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Varhimo E Varmanen P Fallarero A Skogman M Pyörälä S Iivanainen A Sukura A Vuorela P Savijoki K 《Veterinary microbiology》2011,149(3-4):381-389
Streptococcus uberis is an environmental udder pathogen that infects cattle and can cause persistent intramammary infection (IMI), despite the fact that isolates are mainly susceptible to antibiotics. As biofilm growth can cause persistent infection, the ability of ten S. uberis isolates from clinical and subclinical IMIs to form biofilms on the polystyrene surface of a conventional 96-microplates model was examined. Biofilm formation was judged by different staining methods (crystal violet and resazurin) and by atomic force and fluorescence microscopy. These analyses revealed that two out of ten S. uberis strains tested were able to form biofilms. Upon treatment with Proteinase K, biofilms of S. uberis were completely disintegrated, which indicates that biofilm formation is protein-mediated in these strains. Addition of trace amounts of milk, the natural growth medium of S. uberis, significantly increased biofilm formation by most of the strains initially classified as non-biofilm producers. Alpha-casein and β-casein were the primary inducers of biofilm growth, and casein degradation by serine protease activity was required to achieve maximal biofilm production. These results suggest that the extracellular proteolytic activity of S. uberis contributes to an increased biofilm formation. Such a mode of growth induced by host proteins might help to explain the persistence of IMIs caused by this pathogen. 相似文献
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采用浓度梯度递增法对3株不同生物被膜形成能力的大肠埃希菌进行4种氨基糖苷类药物(阿米卡星、链霉素、庆大霉素和安普霉素)诱导,考察大肠埃希菌生物被膜对其余8种不同抗菌药物最小抑菌浓度和最小膜清除浓度的变化规律。结果表明,在氨基糖苷类药物诱导压力下,3株不同生物被膜形成能力的菌株对其余8种抗菌药物的最小膜清除浓度比最小抑菌浓度至少增加8倍以上,与诱导前相比,大肠埃希菌形成生物被膜后,其最小膜清除浓度增加的速率比最小抑菌浓度快。 相似文献
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通过细胞培养板法研究了猪链球菌2型生物被膜的生物学特性。结果显示:大部分猪链球菌均具有不同程度形成生物被膜的能力,其中3株(3/15)形成能力较强;猪链球菌生物被膜的成熟约需60 h,培养基中葡萄糖浓度是影响生物被膜形成的重要因素;生物被膜中的多糖含量显著高于浮游菌;氨苄青霉素钠和阿莫西林对这3株猪链球菌生物被膜的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)均高于游离菌约2 500倍;扫描电镜观察发现,生物被膜内猪链球菌彼此黏连,形成致密的三维立体结构。对猪链球菌生物被膜生物学特性的研究为进一步揭示生物被膜的形成机制、耐药机理,以及清除生物被膜等提供理论依据。 相似文献
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试验旨在比较分析猪源约氏乳杆菌L-76和嗜淀粉乳杆菌L-102被膜态和浮游态下其上清液对病原菌的抑菌活性。采用结晶紫染色法测定L-76和L-102的生物被膜形成能力,研究其被膜态和浮游态乳杆菌上清液及上清液与不同影响因素作用后的抑菌活性,并利用扫描电镜观察其两种状态下的上清液对指示菌形态的影响。结果显示,L-76、L-102乳酸菌具有较强的生物被膜形成能力,被膜态和浮游态乳杆菌L-76、L-102具有良好的抑菌活性,其上清液经蛋白酶作用后,被膜态L-76和L-102上清液的抑菌圈直径比浮游态明显变小;经过氧化氢酶和不同温度作用后,两种状态的乳杆菌上清液的抑菌活性无明显变化（P>0.05）,但在pH 3.0作用下,两种状态的乳杆菌上清液的抑菌效果最好;扫描电镜结果显示,被膜态乳杆菌上清液对金黄色葡萄球菌的形态影响略大。综上所述,两种状态下乳酸杆菌上清液中均含有抑菌物质,且被膜态乳酸杆菌上清液中的抑菌物质含量略多或活性略高。 相似文献
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Melchior MB Fink-Gremmels J Gaastra W 《Journal of veterinary medicine. B, Infectious diseases and veterinary public health》2006,53(7):326-332
Mastitis is one of the most important diseases in dairy cattle of which Staphylococcus aureus is a major pathogen. Despite an apparently good antimicrobial susceptibility in vitro, the cure of diseased animals from this bacteriological infection is often disappointing, which results in cases of recurrent clinical- and chronic subclinical infections. It has been suggested that these recurrent and chronic Staphylococcus infections can be attributed to the growth of bacteria in biofilm. The objective of this study was to compare the susceptibility for antimicrobial agents of S. aureus isolates obtained from bovine mastitis growing under different conditions. These conditions include a conventional conventional microbroth dilution assay in which minimal inhibitory concentration values are determined, the MBEC assay which measures both the susceptibility in biofilm and the susceptibility of sequester cells released from the biofilm. A comparison of the susceptibility for antimicrobial agents of a number of representative S. aureus isolates grown in broth (representing in vitro growth conditions) or milk (representing in vivo growth conditions) is also made. The results indicate that S. aureus isolates obtained from bovine mastitis are highly resistant to antimicrobial agents when growing in biofilms. 相似文献
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Edwardsiella tarda is a Gram-negative broad-host-range pathogen that causes hemorrhagic septicemia in many commercially important fish species. Its ability to adapt to and thrive in diverse environments outside and inside of its hosts prompts us to investigate the roles of the previously identified 33 putative two-component signal transduction systems (TCSs) in E. tarda. In this work, we successfully constructed deletion mutations in each of the response regulator genes, suggesting that none of the TCSs are essential for cell viability in E. tarda. The mutants were further examined for roles in biofilm formation, antibiotic resistance, stress response, expression and secretion of proteins involved in either the type III secretion system (T3SS) or type VI secretion system (T6SS), as well as virulence. Through these assays, we identified four regulators of biofilm development, two regulators of antibiotic resistance, and four regulators involved in stress responses. We found that two regulators, EsrB and PhoP, are essential for the pathogenicity of E. tarda and further demonstrated that these two regulators have codependent and independent contributions to E. tarda virulence. Mutation of EsrB resulted in the complete loss of both the T3SS and T6SS proteins, while PhoP partially regulated the expression of T3SS and T6SS genes through EsrB, and was essential for resistance to antimicrobial peptides. This work suggested that these two response regulators are involved in the regulation of the complex virulence network of this bacterium and merit as candidate genes for live attenuated vaccine construction. 相似文献
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大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2（Escherichia coli type III secretion system 2，ETT2）参与禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli，APEC）的致病作用。本研究旨在探究ETT2结构基因epaPQR对禽致病性大肠杆菌的生物学特性及致病作用的影响，为进一步阐明ETT2的致病机制提供依据。基于CRISPR-Cas9基因编辑技术，构建epaPQR基因缺失株和回复株，通过生长曲线测定、运动性和生物被膜形成能力等试验，分析epaPQR基因对APEC生物学特性的影响；通过血清杀菌与组织载菌量等试验分析epaPQR基因对APEC致病性的影响。结果表明，成功构建ETT2结构基因epaPQR基因缺失株和回复株，epaPQR基因缺失后，其生长能力和生物被膜形成能力并没有显著改变（P>0.05）；但epaPQR基因缺失后，其运动能力显著降低（P<0.05），在透射电镜下观察到缺失株鞭毛数量明显减少，通过荧光定量PCR发现，鞭毛T3SS结构基因及鞭毛输出蛋白基因的转录水平均显著下调（P<0.05）。epaPQR基因缺失后其抗血清杀菌能力显著增强（P<0.05），缺失株AE81ΔepaPQR在雏鸡体内不同器官的定殖能力显著降低。结果说明，ETT2结构基因epaPQR参与调控APEC的鞭毛形成，影响APEC抗血清杀菌能力以及在体内组织器官的定殖能力，表明epaPQR在APEC致病过程中发挥重要作用，本研究为深入探究ETT2功能和APEC致病机制提供参考。 相似文献