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试验旨在构建pET28a-DCpep-GSE原核表达载体，并制备猪链球菌（Streptococcus suis）重组表位蛋白。应用生物信息学方法预测猪链球菌保护性抗原三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、烯醇化酶（Enolase）、DNA核酸酶（SsnA）的跨膜区结构、信号肽、B细胞表位、辅助T细胞（Th细胞）表位及蛋白的二级结构；设计重组蛋白（DCpep-GSE蛋白）的氨基酸序列并分析其理论等电点、亲疏水性等理化性质；构建重组原核表达载体pET28a-DCpep-GSE，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，优化诱导表达条件，His镍柱纯化并检测目的蛋白的细胞毒性和溶血性。结果显示，SsnA蛋白第1-50及1 036-1 059位氨基酸为胞内或跨膜片段，第1-56位氨基酸为信号肽片段，GAPDH和Enolase无跨膜区及信号肽；B细胞和Th细胞表位处于二级结构中的无规则卷曲与β-转角区域，表位抗原性良好；DCpep-GSE蛋白共373个氨基酸，分子质量为45.3 ku，理论等电点（pI）为4.57，平均亲水性（GRAVY）为-0.677，属于酸性亲水性蛋白；质粒双酶切得到5 369 bp的载体条带和1 131 bp的目的条带，PCR扩增产物测序结果与设计序列一致，载体构建正确；以1 mmol/L IPTG于37 ℃诱导6 h蛋白表达量最高，超声破碎后得到可溶性蛋白；试验组蛋白浓度为500 μg/mL时，RAW264.7、PK15和MARC145细胞的相对增殖率分别达到92.3%、99.5%和99.7%，细胞形态与对照组一致，生长旺盛；各样品组的溶血率均<5%。本研究设计了重组蛋白DCpep-GSE，成功地表达和纯化了DCpep-GSE蛋白，并验证了其安全性，为后续猪链球菌病亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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为了探究本课题组前期构建的由猪链球菌(SS)的分泌型DNA核酸酶A(SsnA)、二氢硫辛酰胺脱氢酶(DLDH)和高亲和力锌摄取系统蛋白(ZnuA)3个毒力因子的优势细胞表位和树突状细胞靶向肽(DC3pep)串联而成的重组蛋白DC3pep-SDZ(SsnA-DLDH-ZnuA)对致病型SS攻击斑马鱼的免疫保护效果,本试验表达和纯化重组蛋白DC3pep-SDZ和SDZ,分别免疫AB系野生型斑马鱼,攻击致病型2、3和9型SS(SS2、SS3和SS9),计算存活率,采用苏木精-伊红(H.E.)染色法观察斑马鱼脑组织病理变化,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析SS3感染斑马鱼后脑组织炎性细胞因子表达量变化。结果显示,诱导表达的重组蛋白DC3pep-SDZ和SDZ分子质量分别为44和42 kDa, 2个蛋白均以可溶的形式表达。SS2、SS3和SS9攻击斑马鱼后,重组蛋白DC3pep-SDZ组和重组蛋白SDZ组斑马鱼存活率分别为50.0%、65.0%和60.0%,45.0%、47.3%和45.0%,两组间差异不显著(P>0.05),但与PBS对照组相比差异均极其显著(P<0.001... 相似文献
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试验旨在研究抗菌肽Temprine-La(S)(T-La(S))、Temprine-La(FS)(T-La(FS))、RGD-T-La(S)和RGD-T-La(FS)对2型猪链球菌(SS2)生物被膜形成的抑制作用。通过结晶紫染色法(CV)检测SS2生物被膜形成能力;微量稀释法测定抗菌肽对SS2生物被膜的最小生物被膜抑菌浓度(MBIC)和最小生物被膜杀菌浓度(MBEC);结晶紫染色法和扫描电镜(SEM)检测抗菌肽对SS2生物被膜形成的影响;XTT法检测抗菌肽对SS2生物被膜代谢活性的影响;苯酚硫酸法检测抗菌肽对SS2生物被膜胞外多糖含量的影响;建立猪链球菌-斑马鱼感染模型,HE染色法观察T-La(FS)对斑马鱼脑组织病理变化的影响;实时荧光定量PCR法分析抗菌肽对SS2生物被膜相关基因及对斑马鱼炎性细胞因子基因转录水平的影响。结果显示,SS2具有良好的生物被膜形成能力;T-La(S)、RGD-T-La(S)、T-La(FS)和RGD-T-La(FS)对SS2生物被膜的MBIC分别为31.3、15.6、7.8和15.6μg/mL;MBEC分别为62.6、31.2、15.6和31.2μg/mL;结晶紫染色结果表明,抗菌肽对SS2生物被膜的形成有抑制作用;扫描电镜结果显示,抗菌肽使SS2生物被膜中的细菌数量和生物被膜的形态发生明显变化,细胞外基质大量减少;XTT法结果显示,抗菌肽可显著降低SS2生物被膜的代谢活性;苯酚硫酸法结果显示,抗菌肽能有效抑制SS2生物被膜合成胞外多糖;实时荧光定量PCR结果表明,抗菌肽作用后降低了SS2生物被膜基因的转录水平;T-La(FS)作用后TLR2、MyD88及促炎性细胞因子基因的转录水平显著或极显著降低(P<0.05;P<0.01),抗炎性细胞因子基因的转录水平显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01)。抗菌肽主要通过影响生物被膜相关基因转录水平和阻断胞外多糖的合成与分泌来抑制SS2生物被膜的形成,其中T-La(FS)可能通过抑制TLR2信号通路中TLR2和MyD88分子表达,抑制炎性细胞因子的释放,减轻脑膜炎的炎性反应。 相似文献
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试验旨在研究抗菌肽Temprine-La（S）（T-La（S））、Temprine-La（FS）（T-La（FS））、RGD-T-La（S）和RGD-T-La（FS）对2型猪链球菌（SS2）生物被膜形成的抑制作用。通过结晶紫染色法（CV）检测SS2生物被膜形成能力；微量稀释法测定抗菌肽对SS2生物被膜的最小生物被膜抑菌浓度（MBIC）和最小生物被膜杀菌浓度（MBEC）；结晶紫染色法和扫描电镜（SEM）检测抗菌肽对SS2生物被膜形成的影响；XTT法检测抗菌肽对SS2生物被膜代谢活性的影响；苯酚硫酸法检测抗菌肽对SS2生物被膜胞外多糖含量的影响；建立猪链球菌-斑马鱼感染模型，HE染色法观察T-La（FS）对斑马鱼脑组织病理变化的影响；实时荧光定量PCR法分析抗菌肽对SS2生物被膜相关基因及对斑马鱼炎性细胞因子基因转录水平的影响。结果显示，SS2具有良好的生物被膜形成能力；T-La（S）、RGD-T-La（S）、T-La（FS）和RGD-T-La（FS）对SS2生物被膜的MBIC分别为31.3、15.6、7.8和15.6 μg/mL；MBEC分别为62.6、31.2、15.6和31.2 μg/mL；结晶紫染色结果表明，抗菌肽对SS2生物被膜的形成有抑制作用；扫描电镜结果显示，抗菌肽使SS2生物被膜中的细菌数量和生物被膜的形态发生明显变化，细胞外基质大量减少；XTT法结果显示，抗菌肽可显著降低SS2生物被膜的代谢活性；苯酚硫酸法结果显示，抗菌肽能有效抑制SS2生物被膜合成胞外多糖；实时荧光定量PCR结果表明，抗菌肽作用后降低了SS2生物被膜基因的转录水平；T-La（FS）作用后TLR2、MyD88及促炎性细胞因子基因的转录水平显著或极显著降低（P<0.05；P<0.01），抗炎性细胞因子基因的转录水平显著或极显著升高（P<0.05；P<0.01）。抗菌肽主要通过影响生物被膜相关基因转录水平和阻断胞外多糖的合成与分泌来抑制SS2生物被膜的形成，其中T-La（FS）可能通过抑制TLR2信号通路中TLR2和MyD88分子表达，抑制炎性细胞因子的释放，减轻脑膜炎的炎性反应。 相似文献
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为了研究分离的猪多元摩拉菌生物被膜形成能力及相关特性，了解其致病性和耐药情况，试验采集天津市某猪场因患猪繁殖与呼吸道综合征并继发细菌感染而导致死亡的猪的心脏、肺脏进行细菌分离培养、生化试验、16S rDNA基因序列测定，并对分离菌进行药敏试验、生物被膜及相关基因检测、PK-15细胞黏附试验、致病力研究及毒力基因检测。结果表明：分离菌为革兰氏阴性球菌且多成对排列；氧化酶试验呈阳性，不分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、蕈糖、木糖，PCR产物大小为868 bp,结合16S rDNA测序结果经BLAST比对鉴定为摩拉菌属成员，与多元摩拉菌(M.pluranimalium)序列的同源性达99.71%,将分离菌命名为M.pluranimalium 1120;M.pluranimalium 1120对氟苯尼考、林可霉素、阿莫西林、恩诺沙星、左氧氟沙星耐药，对头孢噻肟中度敏感，对头孢曲松敏感；在培养至第60小时时生物被膜形成量达到峰值，并检测到生物被膜基因LuxS、LpxM、CRP、nanH、SiaB;对PK-15细胞的平均黏附率为13.3%,黏附能力较弱；对小鼠致病性弱，腹腔注射1×1011 相似文献
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