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1.
为了建立猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法,利用RT-PCR技术扩增出猪传染性胃肠炎病毒N基因中324 bp的片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,纯化的质粒作为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达5×101拷贝数.μL-1,与猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床TGEVN基因的检测. 相似文献
2.
【目的】建立一种检测猪瘟疫苗病毒(HCLV)含量的荧光定量PCR方法。【方法】用RT-PCR方法扩增HCLV基因200bp片段,构建含有该基因片段的重组质粒,对此重组质粒进行系列稀释后作为SYBR GreenⅠ荧光定量PCR模板,绘制定量检测HCLV的标准曲线。【结果】在(6.4×107~6.4×102)copies/μL模板浓度范围内,荧光定量PCR的扩增效率为92.2%,标准曲线的决定系数为0.9997。该方法的精确灵敏度为640copies/μL,重复性试验的变异系数小于2%,对牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测结果均为阴性。临床检测结果显示,不同商品猪瘟疫苗之间的病毒载量存在明显差异。【结论】建立了1种具有良好特异性与敏感性的HCLV荧光定量PCR检测方法。 相似文献
3.
本研究在牛病毒性腹泻病毒5'UTR基因的保守区设计并合成了1对引物,建立了可以定量检测牛病毒性腹泻病毒核酸的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。该方法建立的标准曲线相关系数R2为0.999,扩增效率为95.9%,熔解曲线为单一峰值,可检测到初始模板中4.1×101copies/μL的牛病毒性腹泻病毒核酸,是常规RT-PCR方法敏感性的100倍。该检测方法与猪瘟病毒、传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型病毒等其它牛源病毒均不发生交叉反应;批内与批间重复性试验变异系数均小于2.2%。本试验建立的荧光定量PCR检测方法可用于牛病毒性腹泻病毒的临床诊断。同时,应用本方法对临床病例的各组织器官进行了病毒RNA定量检测结果表明,胸腺等淋巴组织的病毒含量最高,证实病毒主要侵害淋巴器官,此研究可为临床病例的病毒分离提供借鉴。 相似文献
4.
猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
基于猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的N基因,建立了PEDV的TaqMan探针RT-PCR检测方法。以标准质粒绘制log10拷贝数与Ct之间标准曲线的线性相关系数值为0.996,检测灵敏度为100拷贝/μL,对传染性胃肠炎病毒、繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒和圆环病毒2型等几种猪病毒的检测结果均为阴性,批内和批间的变异系数均小于1%,表明该方法具有良好的特异性、灵敏性和稳定性。对不同代次细胞培养上清中的病毒样品进行检测,结果表明该方法能够满足PEDV野毒株分离过程中的病毒定量检测需要。 相似文献
5.
【目的】建立一种能够实际应用于猪瘟兔化弱毒疫苗中猪瘟病毒含量检测的荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中登录号为AF091507的猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒株的全长基因组序列,在其5′非编码区设计2对特异性引物(标准品引物、定量引物)和1条探针(qPCR-P),通过标准品引物进行RT-PCR扩增及T7 RNA聚合酶体外转录构建标准品RNA。对荧光定量PCR方法的各项条件进行优化,建立猪瘟兔化弱毒荧光定量PCR检测方法,并采用该法对成品猪瘟兔化弱毒疫苗中的病毒含量进行检测。【结果】成功构建了体外转录的标准品RNA,建立了检测猪瘟兔化弱毒的荧光定量PCR方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,比RT-nPCR方法的灵敏度高出1个数量级;该法对标准品RNA检测的线性范围为1.0×108~1.0×102拷贝/μL。对1.0×108,1.0×106,1.0×103拷贝/μL 3种稀释度的标准品RNA进行重复性试验,批内变异系数分别为0.54%,0.52%和0.39%;批间变异系数分别为1.47%,1.85%和1.01%,具有良好的可重复性。应用该方法对不同厂家猪瘟兔化弱毒疫苗中的病毒含量进行测定,可知同一厂家脾淋苗中的病毒含量比细胞苗高出1~2个数量级,而不同厂家同一类型疫苗中病毒含量也有差异,其中脾淋苗差异不大,而细胞苗间的差异较大,最高可达27.2倍。【结论】建立的猪瘟兔化弱毒荧光定量PCR方法,具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,为实际工作中对猪瘟兔化弱毒疫苗的质量监控提供了重要的技术支撑。 相似文献
6.
Taqman探针实时定量PCR检测猪伪狂犬病毒 总被引：4，自引：0，他引：4
选取猪伪狂犬病毒(PRV)基因组中gE基因,设计特异性引物和Taqman探针,利用实时定量PCR来定量检测PRV.利用PCR技术扩增猪伪狂犬病毒gE基因80 bp片段,并克隆到pMD18-T载体上,阳性重组质粒命名为pgE80.pgE80质粒进行10倍系列稀释,作为荧光PCR检测的标准模板,定量拷贝数,并绘制标准曲线.以提取的PRV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)的DNA作为模板,进行特异性检测.该实时定量PCR方法,标准曲线斜率为-0.37,R2=0.992,可以检测到20个拷贝数.PRV能被扩增出S型荧光曲线,而其它病毒均未能扩出.用PRV强毒肌肉注射仔猪,定量PCR比普通PCR更能灵敏而特异地检出呼吸道排毒和血液带毒.建立的实时定量PCR方法可用于临床样品快捷、准确、方便地检测. 相似文献
7.
为建立一种快速、准确检测猪非典型性瘟病毒(APPV)的方法,根据GenBank发布的APPV NS2基因序列,设计合成1对扩增后目的基因片段大小为500 bp的特异性引物。建立的RT-PCR方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)和猪瘟病毒(CSFV)的检测结果均为阴性,该方法对APPV的最低检出量为1μl 4.95×10~4拷贝,重复性试验中组间、组内试验结果均与预期相符。应用该方法对68份疑似患病的仔猪样品进行检测,阳性病料检出率为7.35%。利用Mega7.0绘制APPV系统进化树,对APPV进行遗传进化分析,结果显示本试验检出的APPV(SC株)与中国报道的APPV的亲缘关系较近。建立的APPV RT-PCR检测方法可用于APPV的临床诊断及流行病学检测。 相似文献
8.
《江苏农业学报》2018,(5)
为了快速准确地检测出猪非典型性瘟病毒(APPV)与猪流行性腹泻病毒(PEDV),根据Gen Bank中发布的PEDV S2基因和APPV NS3基因的序列,分别选取PEDV S2基因和APPV NS3基因的保守序列,设计、合成了1对特异性引物。通过对体系进行优化,分别扩增出190 bp和500 bp的特异性片段。建立的双重RT-PCR方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪轮状病毒(RV)的检测均为阴性。对PEDV和APPV的最低检出量分别为1μl 2.65×10~5和1μl 3.56×10~4,对四川遂宁、眉山等地采集到的腹泻、肌肉震颤的病料进行检测,PEDV、APPV阳性病料检出率分别为41. 18%和11. 76%,经分别与特异性检测APPV和PEDV的单一RT-PCR法检测结果进行比较分析,符合率均为100%。与单一RT-PCR检测方法具有相同特异性和重复性,可用于临床检测。 相似文献
9.
《江苏农业学报》2015,(5)
为建立鲜奶中肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic E.coli,EHEC)O157∶H7的特异性检测方法,以EHEC O157∶H7独有的遗传标志性基因Z0372为靶序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有Z0372基因的重组质粒作为标准品进行Taqman荧光定量PCR反应,分析该方法的敏感性、特异性,并检测鲜奶样品以验证Taqman荧光定量PCR实用性和可靠性。结果表明,建立的定量PCR方法在1μl 1×101拷贝至1μl 1×106拷贝之间具有良好的线性关系,相关系数达到0.996,扩增效率112%。该方法的检测灵敏度为1μl 70拷贝,敏感性较高,而且特异性良好,与其他血清型大肠杆菌、沙门氏杆菌和志贺氏菌等易混淆菌株核酸之间没有交叉反应。批间和批内检测的变异系数(RSD)低于2%,表明该方法重复性良好。 相似文献
10.
《江苏农业学报》2015,(4)
为建立快速检测坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)的一步法SYBR Green实时定量RT-PCR方法,本研究根据TMUV NS2A基因的保守序列,设计并合成了1对特异性引物,以体外转录的NS2A基因作为标准品,采用一步法实时定量RT-PCR方法检测TMUV。结果显示该方法标准曲线的决定系数为0.997,具有良好的线性关系;灵敏度为1μl 10拷贝,是常规RT-PCR方法的100倍;并且与其他病毒无交叉反应,批内和批间变异系数分别为0.11%~0.30%和0.88%~1.31%,具有良好的特异性和稳定性。该方法对于TMUV人工感染鸭泄殖腔棉拭子的检测阳性率为100%,而常规RT-PCR检测的阳性率只有71%。因此,本研究所建立的一步法实时定量RT-PCR方法灵敏度高、重复性、特异性好,可以用于TMUV的临床检测。 相似文献
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盐渍肠衣猪瘟病毒实验室检测的相关性研究 总被引：2，自引：2，他引：0
参考GenBank中发表的猪瘟病毒（CSFV）序列,设计一对CSFV特异性引物;从CSFV感染猪盐渍小肠中提取总RNA,经逆转录后进行PCR扩增,在盐渍小肠中成功扩增出与预期大小（168bp）一致的特异性条带,而正常猪和感染猪伪狂犬病病毒的猪小肠扩增结果均为阴性．用此方法对40例盐渍猪肠衣样本进行检测,结果与经典抗原检测方法（抗原捕获ELISA法）一致,而兔体交叉反应试验的阳性检出率为RT-PCR的66．7％,表明本RT-PCR技术能应用于盐渍猪肠衣的CSFV检测． 相似文献
12.
猪瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
根据GenBank中5′端非编码区的靶序列设计了用于TaqMan荧光定量PCR的1对引物及TaqMan探针,以猪瘟活疫苗病毒为模板,在常规PCR的基础上优化了TaqMan荧光定量PCR反应条件,建立了猪瘟病毒（CSFV）TaqMan荧光定量PCR检测方法。其敏感性和特异性试验结果表明,所建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法对CSFV具有很高的特异性,其检测灵敏度可达5.03×10-2μg/μL。说明TaqMan荧光定量PCR适用于CSFV的快速检测。 相似文献
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A multiplex real-time PCR assay for simultaneous detection of classical swine fever virus,African swine fever virus,and atypical porcine pestivirus 
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下载免费PDF全文 SONG Xiang-peng XIA Ying-ju XU Lu ZHAO Jun-jie WANG Zhen ZHAO Qi-zu LIU Ye-bing ZHANG Qian-yi WANG Qin 《农业科学学报》2023,22(2):559-567
With the implementation of the C-strain vaccine, classical swine fever (CSF) has been under control in China, which is currently in a chronic atypical epidemic situation. African swine fever (ASF) emerged in China in 2018 and spread quickly across the country. It is presently occurring sporadically due to the lack of commercial vaccines and farmers’ increased awareness of biosafety. Atypical porcine pestivirus (APPV) was first detected in Guangdong Province, China, in 2016, which mainly harms piglets and has a local epidemic situation in southern China. These three diseases have similar clinical symptoms in pig herds, which cause considerable losses to the pig industry. They are difficult to be distinguished only by clinical diagnosis. Therefore, developing an early and accurate simultaneous detection and differential diagnosis of the diseases induced by these viruses is essential. In this study, three pairs of specific primers and Taq-man probes were designed from highly conserved genomic regions of CSFV (5´ UTR), African swine fever virus (ASFV) (B646L), and APPV (5´ UTR), followed by the optimization of reaction conditions to establish a multiplex real-time PCR detection assay. The results showed that the method did not cross-react with other swine pathogens (porcine circovirus type 2 (PCV2), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), foot-and-mouth disease virus (FMDV), pseudorabies virus (PRV), porcine parvovirus (PPV), and bovine viral diarrhea virus BVDV). The sensitivity results showed that CSFV, ASFV, and APPV could be detected as low as 1 copy mL–1; the repeatability results showed that the intra-assay and inter-assay coefficient of variation of ASFV, CSFV, and APPV was less than 1%. Twenty-two virus samples were detected by the multiplex real-time PCR, compared with national standard diagnostic and patented method assay for CSF (GB/T 27540–2011), ASF (GB/T 18648–2020), and APPV (CN108611442A), respectively. The sensitivity of this triple real-time PCR for CSFV, ASFV, and APPV was almost the same, and the compliance results were the same (100%). A total of 451 clinical samples were detected, and the results showed that the positive rates of CSFV, ASFV, and APPV were 0.22% (1/451), 1.3% (6/451), and 0% (0/451), respectively. This assay provides a valuale tool for rapid detection and accurate diagnosis of CSFV, ASFV, and APPV. 相似文献
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应用病毒分离鉴定、荧光抗体法、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和夹心ELISA 4种方法,分别对23份猪瘟病料组织中的猪瘟病毒(CSFV)进行了检测,并比较4种检测方法的优缺点。结果显示,病毒分离鉴定法准确性较高,诊断比较容易,但存在试验步骤繁琐,所需时间长的缺点;荧光抗体检测法所需时间较短,但需要经验比较丰富人员来判定结果,且存在假阳性结果,特异性比较差;RT-PCR检测法具有快速、敏感等优点,特别是样品保存不理想时更有价值,利用套式PCR(nested-PCR)可以提高检测的特异性;夹心ELISA检测法具有快速、敏感等优点,但在样品保存不理想时会出现假阴性结果。 相似文献
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猪瘟病毒野毒株TaqMan-MGB荧光定量PCR、鉴别方法的建立与应用 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】建立一种快速、敏感、特异地检测猪瘟病毒野毒的一步TaqMan-MGB 荧光定量PCR方法,为临床鉴别猪瘟野毒和HCLV疫苗毒提供了准确可靠的工具。【方法】在猪瘟病毒基因组5′端非编码保守区设计一对猪瘟病毒通用引物和一条特异性MGB探针,通过优化,得到最佳反应体系和反应条件,进行特异性、灵敏度和临床样本符合检验。【结果】该方法在100～10-7范围内线性相关系数为0.998,检测极限达5.3×10-2pg 病毒核酸;对24个质控样本检测结果显示,该方法能检测除猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）以外的猪瘟流野毒株,其它猪相关致病病原检测阴性;对122份疑似猪瘟样本检测的结果与本实验室建立的RT-nPCR方法的符合率为94.3％（115/122）,阳性和阴性符合率分别为86.4％（38/44）和98.7％（77/78）,Kappa值为0.87＞0.75。【结论】建立的一步TaqMan-MGB 荧光定量PCR方法能鉴别猪瘟野毒和HCLV疫苗毒,且特异性好、灵敏度高、与笔者先前建立的RT-nPCR方法对临床样本的检测结果具有高度的一致性。 相似文献
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健康猪扁桃体和流产胎儿分离猪瘟病毒E2基因的序列分析 总被引：4，自引：1，他引：3
用RT-PCR技术对来自广西不同地区的120份健康猪扁桃体和84份流产胎儿材料进行猪瘟病毒检测,得到9份阳性病料,选取其中1份健康扁桃体和 5份流产胎儿阳性材料进行猪瘟病毒E2基因克隆测序,应用DNAstar序列分析软件对6个广西毒株与HCLV、Shimen等国内外毒株进行同源性比较.结果显示,广西毒株之间核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为93.1%～99.6% 和86.3%～99.2%,6个广西毒株E2基因的所有Cys位点都没有变异,可推测CSFV E2蛋白在抗原结构方面依然保持很高的稳定性;与标准毒株和疫苗毒相比,广西毒株在具有中和特性的B、C区域内721和724氨基酸位点发生了变异;遗传进化树分析表明,猪瘟病毒主要分为两大群和一个另类,广西株皆属于基因群Ⅰ,与我国的主要参考毒株HCLV、Shimen属于同一基因群,说明广西CSFV株与HCLV、Shimen变异不大. 相似文献
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猪瘟病毒与猪流行性乙型脑炎病毒复合RT-PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
猪瘟病毒(CSFV)和流行性乙型脑炎病毒(JEV)是引起种猪繁殖障碍的病原,而且经常混合感染,及时准确诊断是防治的前提.根据CSFV的E2基因保守序列和JEV的E基因保守序列,选取 2 对引物建立检测CSFV、JEV的复合RT-PCR方法,分别扩增出了大小为 508 和1 015 bp 特异性基因片段.应用此方法检测了10份临床样品(淋巴结、脾、肝、肺等组织),结果4份CSFV阳性,3份JEV阳性,其余为阴性.结果表明此CSFV 和 JEV 复合RT-PCR 诊断方法,具有很好的特异性和敏感性,可用于临床检测. 相似文献
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A novel real-time RT-PCR with TaqM an-MGB probes and its application in detecting BVDV infections in dairy farms 下载免费PDF全文
下载免费PDF全文 ZHANG Yong-qiang LIU Hai-sheng WU Xiao-dong WANG Xiao-zhen LI Jin-ming ZHAO Yonggang Lü Yan REN Wei-jie GE Sheng-qiang WANG Zhi-liang 《农业科学学报》2015,14(8):1637-1643
A real-time RT-PCR assay using Taq Man-MGB probes was developed to detect and type the bovine viral diarrhea virus(BVDV) in cattle.Universal primers and Taq Man-MGB probes were designed from the 5′-untranslated region of known pestiviral sequences.Prior to optimizing the assay, c RNAs were transcribed in vitro from the BVDV 1 and BVDV 2 RTPCR products to make standard curves.The detection limit of the assay was 1.72×102 copies for BVDV 1 and 2.14×102copies for BVDV 2.The specificity of the assay evaluated on several BVDV strains including bovine herpesvirus 1(BHV 1), foot and mouth disease virus(FMDV) and several classical swine fever virus(CSFV) strains showed specific detection of the positive virus over 40 cycles.The assay was highly reproducible with the coefficient of variance ranging from 1.04 to 1.33% for BVDV 1 and from 0.83 to 1.48% for BVDV 2, respectively.Using this method, we tested a total of 2 327 cattle from three dairy farms for the presence of BVDV persistently infected(PI) animals.In this assay, each RT-PCR template contained a mixture of ten samples from different animals.The occurrence rate of PI cattle in three farms ranging from 0.9 to 2.54% could represent partly the PI rates in cattle farm in China.In conclusion, using our real-time PCR assay, we could effectively detect and type BVDV and identify PI cattle in a rapid and cost-effective manner. 相似文献