鹅细小病毒VP3基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中表达   总被引：2，自引：0，他引：2  

高光  张鑫  徐佳  王淳玉  许洪洁  胡桂学 《中国兽医学报》2010,30(3)

根据已发表的鹅细小病毒(GPV)B株核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增GPV吉林分离株主要结构蛋白VP3基因,获得大小为1605bp的核苷酸片段。将该片段纯化后克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌JM109,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。经过酶切和连接反应,将VP3基因克隆入真核表达载体pVAX1,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行了PCR和酶切鉴定。通过脂质体法将pVAX1-VP3转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光法检测。结果显示,VP3基因克隆成功,与GPVB株核苷酸序列同源性为96.2%;PCR和酶切鉴定结果证实,成功构建了含VP3基因的GPV真核表达载体pVAX1-VP3。提取转染该质粒的Vero细胞RNA,RT-PCR扩增,在1000～2000bp可见一明显DNA条带;间接荧光抗体染色转染细胞,在细胞表面可见特异荧光。  相似文献   

用地高辛标记核酸探针检测鹅细小病毒的研究   总被引：11，自引：2，他引：9  

布日额  王君伟  吴金花  孙红梅  Ulrich Neumann 《畜牧兽医学报》2004,35(1):102-105

从带有鹅细小病毒(GPV)NSI基因的重组质粒pMD18T-NS1用限制性内切酶EcoRI和BamH1双酶切回收1880bp大小片段,并制备出地高辛标记的GPV核酸探针。其标记效率达到0．01pg／μl。特异性检测结果表明,该探针能与GPV不同毒株核酸发生特异性杂交,而与对照的DPV、GPPV等病毒的核酸杂交反应均为阴性;敏感性检测结果表明,该探针对GPV的最低检出量为0．0224pg。该探针对不同方法处理的GPV感染病料进行检测,均出现杂交阳性。表明所研制的标记探针用于GPV的检测足可行的。  相似文献   

用于检测小鹅瘟抗体的Dot-ELISA建立     

布日额  王君伟  吴金花 《中国家禽》2009,31(11)

以小鹅瘟病毒(GPV)VP1-VP3非重叠序列重组原核表达多肽为检测抗原,建立了鉴别GPV全病毒抗体与VP3亚单位抗体的Dot-ELISA.该方法中检测抗原包被浓度为70ng/斑点,兔抗鹅IgG-HRP标记抗体的最适稀释度为1:200,被检血清最佳稀释度为1:400.特异性试验的结果中,检测抗GPV抗体的阳性率为100%,而抗GPV-VP3禽痘重组病毒抗体的阳性率为0,表明其有很好的特异性与灵敏度.  相似文献   

应用PCR技术检测鹅细小病毒   总被引：12，自引：1，他引：11  

布日额  王君伟  吴金花  邢明伟  韩先杰  高宏丽  李洪涛  刘兴华 《畜牧与兽医》2003,35(6):8-10

根据鹅细小病毒GPVH1株结构蛋白VP1与VP3编码基因非重叠核苷酸序列设计了一对引物GPR1 /GPR2 ,用这对引物对感染器官内的GPR和接种鹅胚增殖的GPV进行PCR扩增 ,其结果引物GRP1 /GPR2能特异性地扩增GPVVP1 VP3区段核苷酸序列 ,扩增出与设计核苷酸片段大小相符的 0 6kb的序列 ,而对照的鹅副粘病毒cDNA及鸭瘟病毒 (DPR)DNA对照组均出现阴性结果。  相似文献   

鹅细小病毒不同毒株VP13基因的克隆与序列分析   总被引：1，自引：0，他引：1  

韦艳梅  曹宗喜  廖明  张桂红  郑煦灿  单芬  罗开健 《动物医学进展》2010,31(8):55-59

分别将鹅细小病毒(GPV)的5个分离株通过PCR技术,从病毒基因组DNA中扩增出病毒蛋白VP1和VP3非重叠区的基因片段(VP13基因),并与pMD18-T质粒载体连接,转化到感受态大肠埃希菌Top10中,经PCR鉴定后,对插入片段进行序列测定及分析。结果表明,5株GPV VP13基因全长均为594 bp,编码198个氨基酸。不同毒株主要结构蛋白VP13基因与国外已发表的鹅细小病毒B株核苷酸序列相似性较高(93.4%～98.7%),但毒株间也存在一定差异。  相似文献   

鹅细小病毒VP1-VP3非重叠区基因的克隆与序列分析     

王志强  刘力威  杨旭东  李洪彬  黄芳芳  邹跃  陈亮  黄宇翔 《中国家禽》2011,33(19)

通过克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)分离株VP1-V3非重叠区基因,并对其进行序列分析,为鹅细小病毒感染与疫苗免疫的鉴别诊断奠定理论基础.进行鹅胚病毒增殖,收集尿囊液,提取基因组,参考发表的B株序列,设计合成一对引物,经PCR扩增,克隆VP1-VP3基因,筛选阳性克隆,对其进行序列测定及同源性分析.结果表明,克隆的基因片段为901 bp,VP1-VP3基因共594 bp,编码198个氨基酸;弱毒株之间亲缘关系很近,核苷酸同源性99.5％～100％,氨基酸同源性98.5％～100％;强毒株与B株亲缘关系较近,核苷酸同源性96.6％,氨基酸同源性97.5％;弱毒株与强毒株亲缘关系较远,核苷酸同源性92％～93％,氨基酸同源性96％～97.5％;弱毒株与B株亲缘关系最远,核苷酸同源性92.5％～93％,氨基酸同源性93.9％～95.5％.说明强毒株与弱毒株之间核苷酸序列存在差异.  相似文献   

鹅细小病毒国内分离株主要结构蛋白（VP2-VP3）基因的克隆和序列分析     

李雪梅  章金刚  向华  马君  陈晓月 《猪业科学》2001,18(3):31-34

根据国外已发表的鹅细小病毒（GPV）A株基因组核苷酸序列设计了一对引物,对国内两株鹅细小病毒毒株(GPV　CC株)和(GPV　FS株)主要结构蛋白（VP2-VP3）基因进行PCR扩增，并克隆到pCR3.1T载体，分别获得正向、反向连接重组质粒pVPC1、pVPC2和pVPF1、pVPF2，经酶切鉴定筛选出阳性克隆质粒并进行核苷酸序列分析比较，序列分析结果表明：GPV　CC株和GPV　FS株VP2-VP3的核苷酸大小分别为1　764　bp和1　763　bp,其中GPV　CC株与A株同源性达到98.9%；GPV　FS株缺失一个碱基,与A株同源性为93.5%,与GPV　CC株同源性为93%。  相似文献   

鹅细小病毒VP1基因的克隆及序列分析   总被引：5，自引：0，他引：5  

马波王君伟  李洪涛刘宝全 《中国兽医科技》2003,33(12):7-10

参照GenBank中收录的鹅细小病毒(GPV)B株基因序列设计并合成了扩增GPV H1株VP1的1对引物，利用PCR技术扩增出长约2．2kb的目的片段，将其克隆到pMD 18-T载体上，进行了序列测定及分析。测序结果表明，GPV H1株VP1基因由2199个核苷酸组成，编码732个氨基酸。经与B株、YG株进行同源性比较，核苷酸的同源性分别为98．50％和93．18％；推导的氨基酸同源性分别为98．09%和95．77％。  相似文献   

番鸭细小病毒和鹅细小病毒广东株VP1基因的克隆与序列分析   总被引：3，自引：0，他引：3  

季芳  张毓金  杨增岐  宋长绪 《中国预防兽医学报》2004,26(4):245-247,251

参考GenBank中的MDPV FM株和GPV B株全基因序列,设计并合成一对引物,分别对MDPV GD株和GPV GD株的结构蛋白基因(VP1)进行PCR扩增,并克隆到pMD18-T载体,筛选到重组质粒并测序.通过对MDPV GD株和GPVGD株的VP1基因的核苷酸序列分析,这两种病毒VP1基因大小均为2 199 bp,核苷酸序列同源性为87%,而位于VP1基因上的VP2至VP3基因起始密码子之间的核苷酸序列的差异较大,同源性仅为64%.另外对MDPV GD株和GPV GD株与各地方毒株的VP1和VP3基因核苷酸序列的同源性比较,显示它们之间差异较小.  相似文献   

鹅细小病毒YBLJ株VP3基因的真核表达     

张颖  鲁承  赵文婧  陈海迪  高旭 《动物医学进展》2012,33(12)

为了研究鹅细小病毒(GPV)YBLJ株VP3基因的生物学特性,根据已克隆的GPV YBH株VP3基因序列(GenBank:JN836326),设计并合成一对特异性引物,经PCR扩增、克隆、转化、酶切与亚克隆,构建真核表达载体pcDNA-VP3,将鉴定正确的质粒转染至Vero细胞,经RT-PCR检测VP3基因转录水平,通过间接免疫荧光试验(IFA)观察VP3基因表达水平.结果显示,克隆的VP3基因全长约1 605 bp;构建了真核表达载体pcDNA-VP3,经RT-PCR对转染细胞总RNA扩增得到特异性目的片段,IFA检测显示VP3基因在Vero细胞中获得了稳定表达.本研究为GPV核酸疫苗的研制奠定了基础.  相似文献   

鹅细小病毒延边株VP1基因真核表达质粒构建及其在Vero细胞中的表达     

赵文婧  鲁承  杜秋明  高建伟  申峰勇  张颖  李闯  袁娜  房靖添 《畜牧与兽医》2012,44(2):14-17

根据GenBank已发表的鹅细小病毒(GPV)B株基因序列,设计并合成1对含有Xho I和BamH I酶切位点的特异性引物,以提取的GPV基因组DNA为模板,经PCR扩增得到了1 163 bp的目的片段,并将该片段克隆至pMD-18T simple载体中,再将其亚克隆至真核表达载体pVAX1中,构建重组表达质粒pVAX1-VP1。经PCR鉴定、酶切分析和序列测定比较,证实了重组质粒的正确性。通过脂质体法将pVAX1-VP1转染Vero细胞,经间接荧光抗体检测,在Vero细胞表面可见特异性荧光。经RT-PCR扩增得1 163 bp的目的片段。该研究为GPV核酸疫苗的研制奠定了基础。  相似文献   

禽偏肺病毒地高辛核酸探针的制备与应用     

陈琳  刁有祥  鞠小军  慕榕  郑新颖  刘霞  孙静  吴海洋 《兽医大学学报》2012,(1):23-27

根据GenBank中已经发表的B亚型禽偏肺病毒F基因的保守序列设计并合成1对引物,利用RT—PCR扩增出1条与目的片段大小一致的725bp基因片段,回收、纯化PCR产物,用地高辛标记,制备出地高辛标记的aMPV核酸探针。特异性检测结果表明,该探针能与aMPV核酸发生特异性杂交,而与H9N2亚型AIV、NDV、IBV、ORT和E．coil的核酸杂交反应均为阴性;敏感性检测结果表明,该探针对aMPV的最低检出量为5Pg。应用制备的探针对山东省不同地区的605份商品肉鸡和122份商品肉鸭进行了核酸探针检测,阳性检出率分别为36．59％和34．51％。本试验制备的aMPV地高辛探针特异性强、敏感性好,对样品的检测结果表明山东省部分地区的商品肉鸡、肉鸭中普遍存在aMPV感染。  相似文献   

鹅细小病毒和番鸭细小病毒双重PCR检测方法的建立   总被引：1，自引：0，他引：1  

鲜思美  文心田  曹三杰  黄小波 《畜牧与兽医》2010,42(4)

根据GenBank上登录的鹅细小病毒(GPV)和番鸭细小病毒(MDPV)基因序列,分别设计合成针对GPV非结构蛋白(NS)和MDPV NS2-VP1基因片段的2对引物GPV U/L和MDPV U/L,将GPV和MDPV提取核酸混合后作为模板,优化PCR反应条件,建立了能同时检测这2种病毒的双重PCR。特异性试验结果显示,引物GPV U/L仅特异性扩增出GPV-GZ1和GPV-GZ2株730bp核酸片段,引物MDPVU/L仅特异性扩增出MDPV的624bp核酸片段,双重PCR扩增出长度分别为730bp和624bp的2条特异性片段,而扩增鸭瘟病毒(DPV)和鹅副黏病毒(GPMV)的核酸扩增结果均为阴性。敏感性试验结果显示,双重PCR能同时检测到14.4pg的GPV核酸和28.8pg的MDPV核酸。结果表明,建立的双重PCR可用于GPV和MDPV的鉴别诊断和联合检测。  相似文献   

探针检测鸭黄病毒的地高辛标记DNA的制备与应用   总被引：1，自引：0，他引：1  

高绪慧  刁有祥  唐熠  于春梅  张大丙  岳澄滨 《兽医大学学报》2012,(4):525-528

利用RT-PCR方法扩增鸭黄病毒的NS3基因406bp的特异性片段,回收并纯化PCR产物,用地高辛标记,制备核酸探针。特异性试验结果表明,该探针仅与鸭黄病毒的核酸特异性杂交,而与鸭瘟病毒、H9N2禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒的核酸杂交均为阴性。敏感性试验表明,该探针对鸭黄病毒的RNA最低检出限量为100μg/L。对疑似黄病毒感染鸭的肝脏、肺脏、脾脏、输卵管、卵泡膜和泄殖腔棉拭子进行检测,以卵泡膜的检出率最高。该研究为鸭黄病毒感染的诊断和流行病学调查提供了一种可靠的方法。  相似文献   

鹅细小病毒VP3与禽分枝杆菌副结核亚种hsp65融合基因真核表达载体的构建及鉴定   总被引：1，自引：1，他引：0  

张岩 《中国兽药杂志》2013,47(5):6-9

为了构建鹅细小病毒(GPV)的VP3与禽分枝杆菌副结核亚种(MAP)的hsp65融合基因重组真核表达载体,试验克隆了VP3和hsp65基因,并将二者先后插入真核表达载体pVAX1中,构建重组质粒pVAXl-VP3和pVAXl-hsp65-VP3.酶切和PCR鉴定表明表达载体构建正确,用脂质体将二者分别转染入Vero细胞中,间接免疫荧光检测其在细胞中的表达.结果显示,转染细胞表面可见绿色荧光,说明hsp65、VP3基因表达成功.试验为GPV的DNA疫苗研制及hsp65分子佐剂在动物医学中的应用奠定基础.  相似文献