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1.
《中国预防兽医学报》2020,(3)
为建立一种快速检测鸭甲肝病毒(DHAV)1型和3型(DHAV-1、DHAV-3)血清抗体的方法,本研究诱导表达了DHAV-1、DHAV-3重组蛋白VP0、VP1、VP3,并采用ELISA方法比较了3者的反应原性,结果显示DHAV-1 VP0更适合作为检测DHAV-1、DHAV-3血清抗体的通用型诊断抗原。经各反应条件优化,建立了一种基于DHAV-1 VP0重组蛋白的可同时检测DHAV-1、DHAV-3血清抗体的间接ELISA方法。优化的主要反应条件为:抗原包被浓度为0.25μg/m L,待检血清稀释度为1100,山羊抗鸭HRP-IgG 1400稀释。该方法特异性较强,只与DHAV-1、DHAV-3阳性血清反应,与鸭源小鹅瘟病毒(GPV)、鸭病毒性肠炎病毒(DEV)、H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)等阳性血清均无交叉反应;敏感性为1320;批内变异系数小于4%,批间变异系数小于6%;与商品化的ELISA抗体检测试剂盒比较,二者阳性符合率为93.3%,阴性符合率为88.9%,总符合率为95.7%,且该方法可用于临床血清样本的检测。本研究为检/监测DHAV血清抗体水平提供了技术手段。 相似文献
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3.
《中国预防兽医学报》2017,(6)
为建立一种快速检测鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)抗体的化学发光酶联免疫分析方法(CLEIA),本研究从DHAV-1中国流行株中扩增获得病毒结构蛋白VP1编码基因,构建重组原核表达质粒pET-32a-VP1,并进行重组蛋白的诱导表达。将纯化后的重组VP1蛋白作为检测抗原建立了CLEIA检测方法。结果显示,利用建立的CLEIA方法对AIV、AMPV、DPV、ARV、MPV、RAV等病毒血清进行检测,均无交叉反应,特异性强;灵敏度高于ELISA方法;重复性试验变异系数为2.18%~4.33%,具有较好的重复性;且与中和试验的阳性符合率和阴性符合率分别为100%和80%。本研究建立的CLEIA方法可以用于DHAV-1感染监测及疫苗接种后的免疫评价。 相似文献
4.
新型鹅细小病毒(novel goose parvovirus, NGPV)是由鹅细小病毒(goose parvovirus, GPV)变异而来，可感染雏鸭，引起以鸭短喙侏儒综合征为主要特征的传染性疾病。2015年该病在我国鸭群中大暴发，严重影响鸭出栏率，给我国的养殖行业带来巨大的经济损失。为建立一种鸭源NGPV抗体的间接ELISA检测方法，用于鸭感染细小病毒的血清学检测和鸭免疫细小病毒疫苗后抗体水平监测，本研究利用生物信息学预测了NGPV YICH株的结构蛋白VP3的抗原表位，选择了抗原富集区域(aa250～525)进行原核表达，经蛋白纯化获得了可溶性的VP3截短蛋白VP3-tr。以VP3-tr为包被抗原，经过棋盘滴定方法优化各个反应条件，建立了NGPV抗体的间接ELISA检测方法。利用优化后的间接ELISA方法对30份GPV阴性鸭血清进行检测，确定阴阳性临界值为0.219。ELISA方法的灵敏性、特异性和重复性检测结果表明，该方法灵敏度较高，特异性良好，不与鸭坦布苏病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、鸭疫里默杆菌、大肠杆菌病原阳性血清发生交叉反应；批内和批间重复试验的变异系数均小于6%,重... 相似文献
5.
《黑龙江畜牧兽医》2020,(3)
为了评价载体pET-mLTA-CTLA-4对鸭肝炎病毒VP3重组蛋白的免疫增强作用,试验在载体pET-mLTA-CTLA-4上插入鸭甲肝病毒(DHAV)VP3基因,构建重组质粒pET-mLTA-VP3-CTLA-4并表达重组蛋白mLTA-VP3-CTLA-4,用不同剂量的mLTA-CTLA-4蛋白+DHAV-1活疫苗、重组蛋白mLTA-VP3-CTLA-4、DHAV-1活疫苗分别免疫1日龄非免健康雏鸭,用ELISA法定期检测不同免疫处理时鸭的血清抗体IgG及小肠黏膜抗体IgA并进行比较分析;将免疫后的血清与病毒中和后接种鸡胚,判断其免疫保护力。结果表明:重组蛋白mLTA-VP3-CTLA-4可诱导免疫鸭产生特异性IgG和IgA,但其产生的抗体水平稍低于mLTA-CTLA-4蛋白+DHAV-1活疫苗组,血清与病毒混合后能完全中和病毒,在保护试验中鸡胚未见死亡。说明表达的重组蛋白mLTA-VP3-CTLA-4能产生较好的免疫保护力。 相似文献
6.
为建立敏感、特异、稳定的传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2结构蛋白抗体ELISA检测方法,本试验以杆状病毒表达系统表达的重组IBDV-VP2结构蛋白为抗原,通过包被VP2单克隆抗体捕捉VP2结构蛋白的形式,建立鸡血清VP2结构蛋白抗体ELISA检测方法(VP2-ELISA)。条件优化结果显示:单克隆抗体最适包被质量浓度为3mg/L,VP2最佳稀释度为1∶20,夹心ELISA效价1∶12.8,被捡血清的稀释度为1∶400。该方法与禽流感、鸡新城疫、鸡马立克氏病、鸡传染性喉气管炎病毒及杆状病毒阳性血清无交叉反应,对琼扩效价为1∶32的IBDV阳性血清的最低检出量为1∶12 800,ROC曲线确定的D450nm临界值为0.236,组内、组间重复性试验变异系数均小于10%。用本试验建立的VP2-ELISA方法与进口IBDV-ELISA抗体试剂盒平行检测100份背景已知的临床鸡血清样品,总符合率VP2-ELISA(97%)高于进口ELISA试剂盒(96%)。本试验为进一步研制鸡传染性法氏囊病病毒VP2结构蛋白抗体ELISA检测试剂盒奠定基础。 相似文献
7.
《黑龙江畜牧兽医》2020,(14)
为了建立一种检测A型塞内卡病毒(SVA)VP2蛋白抗体的阻断ELISA方法,试验用SVA VP2蛋白作为抗原包被酶标板,采用棋盘法确定最佳蛋白包被浓度和单克隆抗体最佳稀释倍数。同时对阻断ELISA的其他条件(封闭液、血清稀释度、底物反应条件)进行优化,对方法的特异性和重复性进行考察。结果表明:VP2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL;最佳封闭液为2%BSA,每孔200μL,37℃封闭1 h;待检血清最佳稀释度为1∶1,在37℃条件下作用1 h;单克隆抗体最佳稀释度为1∶40 000,在37℃条件下作用1 h;底物最佳反应条件为室温避光10 min。特异性试验结果显示,SVA阳性血清与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综征病毒、猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应。批间、批内重复性试验结果的变异系数均小于10%。对200份猪血清样本进行荧光抗体中和试验和阻断ELISA方法检测,符合率为96.0%。说明该ELISA方法具有良好的特异性和重复性,可用于塞内卡病毒血清抗体检测和流行病学调查。 相似文献
8.
为建立特异性和敏感性较高的鸭坦布苏病毒(DTMUV)抗体检测方法,采用原核表达系统对DTMUV E蛋白的DⅢ结构域进行了双串联融合表达,SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白大小约25 Ku。Western blot结果显示,经亲和层析纯化的重组蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应。以纯化的重组DⅢ蛋白作为包被抗原,初步建立了检测DTMUV血清抗体的间接ELISA方法。采用梯度稀释法对ELISA各种反应条件进行优化,确定最适工作条件。重组抗原最适包被浓度为5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶100,兔抗鸭酶标抗体最适稀释度为1∶1000;抗体临界值S/P≥0.336判定为阳性,S/P≤0.287判定为阴性,介于两者之间为可疑。该方法检测禽流感病毒、鸭源新城疫、鸭甲肝病毒、鸭圆环病毒、鸭细小病毒、经典呼肠孤病毒及新型鸭呼肠孤病毒等血清均为阴性,4个批次批内与批间重复试验的OD值变异系数分别为6.21%~7.27%和3.4%~7.2%,显示该法具有很好的特异性、稳定性和重复性。用建立的间接ELISA与中和试验分别对108份疑似鸭坦布苏病血清样品进行检测,两种方法的阳性符合率为83.3%。 相似文献
9.
基于VP1重组蛋白的口蹄疫病毒O型间接ELISA检测技术 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR方法扩增O型口蹄疫病毒VP1基因片段,将其克隆于pET-32a.将重组质粒转化宿主菌Rosetta,经1.0 mmol/L IPTG诱导,外源基因获高效表达.通过Western-blot以及ELISA试验证明,重组VP1蛋白与标准阳性血清发生反应.以纯化的VP1蛋白作为检测抗原包被酶标板建立了检测口蹄疫病毒O型抗体的间接ELISA方法.对355份临床血清样品的检测结果显示,建立的方法与口蹄疫病毒O型液相阻断试剂盒符合率为98.87％.表明建立的方法能够用于口蹄疫病毒O型抗体的快速分型检测. 相似文献
10.
为建立1种禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus, AEV)抗体检测方法,试验对AEV VP1蛋白进行截短表达,以表达蛋白为包被抗原建立检测AEV抗体的间接ELISA方法。结果显示,重组VP1蛋白以包涵体形式表达,大小为34 kDa;可与AEV阳性血清发生特异性反应;以VP1蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法检测ALV、IBDV、IBV、ILTV、NDV、AIV-H9阳性血清均为阴性;检测AEV抗体的最低检出效价为1∶51 200;与IDEXX试剂盒的符合率为95.24%;检测新疆地区1 127份AEV疫苗免疫鸡血清样品和879份未免疫鸡血清样品的免疫抗体阳性率和感染抗体阳性率分别为88.91%和8.19%。结果表明,建立的间接ELISA方法特异、敏感、准确,可用于临床中免疫抗体和野毒感染抗体的检测和筛查。 相似文献
11.
为建立检测基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)血清抗体的方法,本研究以纯化的DHAV-C作为包被抗原,抗DHAV-C单克隆抗体(MAb)5E3-9与待检血清竞争结合抗原,采用方阵法确定包被抗原、MAb及待检血清的最佳工作浓度,经过对反应条件的优化,建立了DHAV-C抗体的竞争ELISA检测方法。该方法仅对DHAV-C血清检测为阳性,与DHAV-A、鸭圆环病毒、鸭乙型肝炎病毒等相关病原的鸭阳性血清无交叉反应。敏感性试验表明,标准阳性血清1:128倍稀释时,检测结果仍为阳性,比中和试验灵敏性更高。批内批间变异系数分别为4.64%~5.21%和6.02%~8.68%,具有良好的重复性。与中和试验比较,阳性符合率为100%(15/15),阴性符合率为77.8%(14/18)。本研究基于纯化的DHAV-C及其特异性MAb建立的MAb竞争ELISA检测方法可以用于DHAV-C流行病学调查以及抗体的检测。 相似文献
12.
《畜牧兽医学报》2016,(1)
旨在探究1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)VP3蛋白抗血清的中和活性并鉴定VP3的线性B细胞表位。利用pGEX-4T-1表达载体,在BL21(DE3)宿主菌中原核表达DHAV-1 VP3基因,以切胶纯化出的蛋白质为抗原免疫兔制备多克隆抗体,通过鸡胚中和试验对多抗的中和效价进行检测;采用KarplusSchulz、Emini、Jameson-Wolf和Parker方法分别对柔韧性、表面可及性、抗原性及亲水性进行分析,得到了4条候选线性B细胞表位,以制备的兔抗VP3多克隆抗体为一抗,通过间接ELISA方法对人工合成的B细胞表位进行鉴定,并进一步用临床鸭血清样品对鉴定的B细胞表位的抗体检测能力进行评估。结果显示,VP3在BL21(DE3)中以包涵体形式表达,大小约54ku,Western blot分析表明重组蛋白质具有较好的反应原性。制备的兔抗VP3多克隆抗体的琼扩效价达到1∶16,并能中和DHAV-1,中和效价为1∶39;利用间接ELISA鉴定出GKRKPCRRPIHKPKNPPQEP(1—20aa)、FNTGRYQMSWYPIADGEQSL(131—150aa)和VNSSAPSNID(200—209aa)为VP3的B细胞表位,抗体检测能力试验结果显示表位肽可检测临床DHAV-1鸭血清。本研究表明DHAV-1VP3的抗血清具备一定的中和活性,1—20aa、131—150aa和200—209aa为VP3的B细胞表位且具有临床应用前景。 相似文献
13.
口蹄疫病毒结构蛋白基因vp1的表达与应用研究 总被引：2，自引：0，他引：2
体外克隆口蹄疫病毒vp1基因，构建重组表达载体pET28a-vp1。将此重组质粒转化到受体菌BL21（DE3）中，进行诱导表达，SDS-PAGE和蛋白质印迹分析表明，诱导5h后表达量达到最高，表达产物大小约为33Ku-40Ku，表达蛋白能与口蹄疫病毒阳性血清产生特异性免疫反应。经HPLC纯化后，以重组蛋白为抗原，建立检测VP1蛋白抗体的ELISA方法，检测猪牛血清样品，免疫抗体检测结果与口蹄疫液相阻断ELISA检测结果呈正相关，能反映出免疫抗体动态变化，对临床样品口蹄疫病毒血清抗体检测，两种方法有一定相关性，但不显著。所以以重组VP1蛋白为检测抗原的ELISA方法有望用于口蹄疫免疫抗体监测。 相似文献
14.
为了检测鸭群中鸭坦布苏病毒的血清学流行情况,本研究在前期成功表达鸭坦布苏病毒NS1蛋白的基础上,建立了检测鸭血清中鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法。棋盘法确定了当纯化的NS1蛋白包被量为0.188μg/孔,待检血清1:200稀释,HRP标记的兔抗鸭二抗1:16000倍稀释时反应条件最佳。在最佳反应条件下,阴阳性临界值判定标准为0.467。用建立的间接ELISA方法对番鸭细小病毒、鹅细小病毒、鸭肝炎病毒、鸭疫里默氏杆菌阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复试验的最大变异系数分别为6%和10%,显示该方法具有很好的稳定性。用建立的ELISA方法检测临床鸭坦布苏病毒感染鸭及攻毒蛋鸭的55份临床血清样品,测得52份为阳性,阳性率为94.5%,对36份阴性鸭群血清样品进行检测,36份为阴性,阴性率为100%。该方法为鸭坦布苏病毒的诊断和流行病学监测奠定了基础。 相似文献
15.
为建立兔出血症病毒(RHDV)的血清学检测方法,本实验通过生物信息学分析,将RHDV衣壳蛋白VP60的3个区域VP60-1(aa2-aa208)、VP60-2(aa174-aa425)和VP60-3(aa342-aa579)分别进行原核表达,获得了大小为42 ku、47.5 ku和45.6 ku的重组蛋白。经ELISA和western blot试验分析显示3种重组蛋白均能够被RHDV阳性血清识别,但VP60-1较VP60-2和VP60-3具有更好的反应原性,因此以表达的重组蛋白VP60-1作为包被抗原建立了RHDV间接ELISA抗体检测方法。结果显示,该方法具有较好的敏感性、特异性和重复性,对不同免疫期兔血清的检测结果与HI呈显著相关性。对临床样品的检测结果表明该ELISA方法比HI试验更敏感。本研究以VP60-1为包被抗原建立的ELISA方法可以用于RHDV疫苗的免疫评估。 相似文献
16.
为建立快速检测塞内卡病毒A (Senecavirus A,SVA)血清学方法,以纯化的重组VP1蛋白作为包被抗原,建立了SVA VP1间接ELISA抗体检测方法。结果表明,VP1蛋白以包涵体形式表达,纯化后的蛋白经Western blot鉴定具有较好的反应原性。该ELISA检测方法阴、阳性临界值为0.278,与口蹄疫病毒(FMDV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等猪常见病原阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。批内和批间重复性试验的变异系数均小于13%,表明该方法重复性和稳定性均较好。相比于血清中和试验(SN),该方法的相对敏感性为98.0%,两种方法的符合率为84%。用该方法对来自山东、广东省的8个猪场的276份血清进行检测,阳性率为22.1%。SVA VP1间接ELISA抗体检测法可作为一种快速、简便的血清学诊断方法,用于猪群SVA感染监测和流行病学初步调查。 相似文献
17.
为制备抗鸭1型甲肝病毒亚型（DHAV-1a）结构蛋白VP1的单克隆抗体（MAbs）,本研究以pGEX-VP1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,同时以纯化浓缩的全病毒作为包被抗原,建立了筛选抗VP1蛋白阳性杂交瘤细胞株的间接ELISA方法,经融合、筛选制备杂交瘤细胞及鉴定MAbs的稳定性、特异性、腹水效价和中和活性等生物学活性,获得了2株持续且稳定分泌抗体的杂交瘤细胞（1A2和5G3）。MAbs腹水ELISA效价分别为1：3.2×104和1：2.0×106。亚类鉴定均为IgG1/κ型。Western blotting结果显示,2株MAbs均能与DHAV-1a VP1蛋白和DHAV-1a全病毒发生特异性反应。特异性试验结果显示2株MAbs能与鸭1型甲肝病毒（DHAV-1）和DHAV-1a发生交叉反应。中和试验结果显示5G3株具有中和活性。结果表明2株MAbs的ELISA效价高、特异性强、稳定性好,均能与DHAV-1和DHAV-1a全病毒发生特异性反应,其中一株具有中和活性。 相似文献
18.
为建立1型鸭甲肝病毒(duck hepatitis A virus type 1,DHAV-1)和鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)抗体的液相芯片检测方法,应用RT-PCR从鸭尿囊液中扩增获得714bp的DHAV-1VP1序列和1 503bp的DTMUV-E序列,将其分别克隆至原核表达载体pCold-Ⅲ和pET-28a(+)并进行表达。通过SDS-PAGE验证DHAV-1-VP1和DTMUV-E蛋白能够有效表达,通过Western blot进一步验证表达的蛋白均可与其对应的阳性血清发生反应。根据xMAP液相芯片技术原理,以表达的重组蛋白为抗原分别与不同编号的微球偶联,获得偶联复合体作为捕获载体,建立DHAV-1和DTMUV抗体单一和双重液相蛋白芯片检测方法。结果表明,DHAV-1和DTMUV的临界值分别为190.30和223.29,灵敏性检测2种阳性血清的抗体水平分别为1∶51 200和1∶6 400,重复性验证批内和批间变异系数分别为1.44%和3.94%,为DHAV-1和DTMUV抗体监测提供了高通量、重复性好、特异性高的抗体检测体系。 相似文献
19.
《中国畜牧兽医》2018,(12)
为建立检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFVp30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFVp30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀释度为1∶4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1∶1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。 相似文献
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使用国产的4种猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体ELISA诊断试剂盒(VP1-ELISA)、猪口蹄疫O型液相阻断ELISA检测试剂盒(LB-ELISA)、猪口蹄疫正向间接血凝试剂盒、猪O型口蹄疫病毒ELISA抗体检测试剂盒(O-ELISA)同时检测猪口蹄疫O型合成肽疫苗免疫后的50份血清样品,阳性率分别为98.0%、94.0%、54.0%、90.0%。同时使用农业部规定的3种试剂盒分别检测20份血清样品的抗体滴度发现,VP1-ELISA试剂盒和LB-ELISA试剂盒阳性符合率为95%,平均抗体滴度相差0.7,与IHA试剂盒符合率为55%,平均抗体滴度相差3.8,故LB-ELISA试剂盒可以用来评价合成肽疫苗免疫的抗体,而IHA试剂盒不能用来检测合成肽疫苗免疫的抗体。 相似文献