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本研究旨在表达A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的衣壳蛋白VP2,并制备其多克隆抗体。以SVA GD01/2017分离株RNA为模板,RT-PCR扩增VP2基因序列,并克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET-30a-SVA-VP2。经测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达。在非变性条件下,利用Ni-NTA琼脂糖树脂从菌体裂解液上清中纯化重组SVA VP2蛋白,并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用Protein A Sepharose CL-4B树脂从兔血清中亲和层析纯化多克隆抗体,并对其进行间接免疫荧光分析。结果显示,重组SVA VP2蛋白以可溶性和包涵体两种形式在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞内进行表达,分子质量约为47ku;制备的兔抗VP2蛋白多克隆抗体效价高达1∶64 000,该多克隆抗体仅识别SVA,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、脑心肌炎病毒、猪瘟病毒和猪伪狂犬病病毒等常见猪病原无交叉反应,表明制备的多克隆抗体具有良好的特异性。重组SVA VP2蛋白及其多克隆抗体的成功制备为猪塞内卡病毒病血清学检测方法的建立提供了良好的生物材料。 相似文献
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A型塞内卡病毒VP2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备 总被引：1，自引：1，他引：0
本研究旨在表达A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的衣壳蛋白VP2,并制备其多克隆抗体。以SVA GD01/2017分离株RNA为模板,RT-PCR扩增VP2基因序列,并克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET-30a-SVA-VP2。经测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达。在非变性条件下,利用Ni-NTA琼脂糖树脂从菌体裂解液上清中纯化重组SVA VP2蛋白,并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用Protein A Sepharose CL-4B树脂从兔血清中亲和层析纯化多克隆抗体,并对其进行间接免疫荧光分析。结果显示,重组SVA VP2蛋白以可溶性和包涵体两种形式在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞内进行表达,分子质量约为47ku;制备的兔抗VP2蛋白多克隆抗体效价高达1∶64 000,该多克隆抗体仅识别SVA,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、脑心肌炎病毒、猪瘟病毒和猪伪狂犬病病毒等常见猪病原无交叉反应,表明制备的多克隆抗体具有良好的特异性。重组SVA VP2蛋白及其多克隆抗体的成功制备为猪塞内卡病毒病血清学检测方法的建立提供了良好的生物材料。 相似文献
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【目的】制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)VP2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。【方法】利用同源重组技术将VP2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-VP2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,表达产物经纯化后皮下多点注射新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用间接免疫荧光试验(IFA)、Western blotting和中和试验鉴定多克隆抗体的特异性、反应性和中和活性。以VP2为抗原包被酶标板,通过矩阵优化、临界值确定、特异性鉴定及敏感性和重复性分析建立检测SVA抗体的间接ELISA方法。采集50份临床血清样品,分别用间接ELISA与IFA方法进行检测,分析间接ELISA方法的符合率。【结果】重组VP2蛋白以包涵体形式表达,大小为40 ku。制备的多克隆抗体能与重组VP2蛋白和SVA特异性结合,与其他病毒无交叉反应,且具有较高的中和活性。经对间接ELISA条件的优化,确定VP2包被浓度为4μg/mL,阳性血清稀释浓度为1∶250,封闭液为5%脱脂... 相似文献
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A型塞内卡病毒(SVA)是一种新兴的猪病原体,可引起母猪水泡样病变和仔猪急性死亡。本研究将SVA的VP1基因分别克隆到原核表达载体pCold-I和pCold-TF,并将测序正确的重组质粒VP1-pCold-I、VP1-pCold-TF转化BL21(DE3)大肠杆菌中,诱导表达重组蛋白。结果显示：VP1-pCold-I表达的目的蛋白在沉淀(包涵体)中,VP1-pCold-TF表达的蛋白为可溶性蛋白。分别纯化上述表达的蛋白,并免疫BALB/c小鼠,经四次免疫后得到多克隆抗体。经Western blot和间接免疫荧光(IFA)鉴定,制备的多克隆抗体具有良好的Western blot效价和IFA效价,为相关基础研究和应用研究提供了工具。 相似文献
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试验以猪塞内卡病毒A(SVA)VP1基因为研究对象,利用基因重组技术构建原核表达载体pET-28a(+)-VP1。重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后经1 mmol/L异丙基茁-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在37益条件下诱导6 h,后经15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳进行检测。结果:SVAVP1基因能在BL21(DE3)中成功表达,融合蛋白相对分子质量约36 kDa;表达的融合蛋白以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,以包涵体为主要存在形式。以上研究结果为后续SVAVP1蛋白的免疫原性的研究及塞内卡病毒病抗体ELISA方法的建立奠定了基础。 相似文献
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为制备抗A型塞内卡病毒(SVA)VP1蛋白的单克隆抗体,并初步应用于A型塞内卡病毒的检测,本研究构建了SVA VP1原核重组表达质粒pET30a-GST-VP1(528 bp)。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21感受态细胞并大量表达VP1重组蛋白,利用纯化的VP1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)进行融合,经过细胞亚克隆筛选,获得杂交瘤细胞。将其选为腹水生产细胞株,最后纯化单克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光试验对其进行鉴定。结果显示,本研究获得1株能够稳定分泌抗VP1重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,其亚型重链为IgG2a、轻链为Kappa链;Western blotting和间接免疫荧光检测显示,该单克隆抗体能够特异性识别SVA病毒粒子。本研究成功制备的抗SVA VP1蛋白单克隆抗体可为进一步研究A型塞内卡病毒VP1蛋白的生物学功能及A型塞内卡病毒致病机制提供有效途径。 相似文献
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为建立高效的A型塞内卡病毒(SVA)的血清学检测方法,本研究经PCR扩增SVA VP2基因的优势抗原区域(VP2-1基因)后构建重组质粒p ET-32a-VP2-1,将其转化大肠杆菌感受态细胞并经IPTG诱导表达重组VP2蛋白(rVP2),表达产物经镍柱亲和层析法纯化后利用western blot鉴定,结果显示,在42 ku处出现特异性条带,表明r VP2可以与SVA阳性血清特异性反应。以r VP2为包被抗原,经反应条件的优化,建立了基于SVA VP2抗原区的间接ELISA抗体检测方法。本研究建立的间接ELISA检测方法的最适抗原包被浓度为2μg/mL,5%脱脂乳的PBST作为封闭液37℃孵育1 h,待检血清的最适稀释度为1∶500,兔抗猪Ig G-HRP稀释度为1∶10 000,最佳显色时间为10 min。当检测样品的S/P值<0.201时,样品检测结果为阴性;当检测样品的S/P值≥0.201时,结果为阳性。利用该方法检测SVA,猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)等阳性血清,结果显示,除SVA检测为... 相似文献
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为建立快速检测塞内卡病毒A (Senecavirus A,SVA)血清学方法,以纯化的重组VP1蛋白作为包被抗原,建立了SVA VP1间接ELISA抗体检测方法。结果表明,VP1蛋白以包涵体形式表达,纯化后的蛋白经Western blot鉴定具有较好的反应原性。该ELISA检测方法阴、阳性临界值为0.278,与口蹄疫病毒(FMDV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等猪常见病原阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。批内和批间重复性试验的变异系数均小于13%,表明该方法重复性和稳定性均较好。相比于血清中和试验(SN),该方法的相对敏感性为98.0%,两种方法的符合率为84%。用该方法对来自山东、广东省的8个猪场的276份血清进行检测,阳性率为22.1%。SVA VP1间接ELISA抗体检测法可作为一种快速、简便的血清学诊断方法,用于猪群SVA感染监测和流行病学初步调查。 相似文献
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【目的】实现A型塞内卡病毒（Seneca virus A,SVA）VP1蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达,以建立SVA抗体液相芯片技术检测方法。【方法】根据GenBank收录的SVA VP1基因序列（登录号：KY747514.1）,基于大肠杆菌的密码子偏好性优化合成VP1基因,克隆到pCold TF载体,构建重组质粒pCold TF-VP1。将重组质粒pCold TF-VP1转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,进行IPTG诱导表达。通过优化诱导时间及IPTG浓度得出最佳诱导表达条件。采用His标签镍柱纯化VP1重组蛋白,将纯化后的SVA VP1蛋白与荧光微球进行偶联,偶联好的微球与阴阳性血清反应,利用Luminex 200系统上机检测背景及阴阳性血清的中值荧光强度（MFI）,从而判断阴阳性,以用于猪血清中SVA抗体的检测。【结果】重组质粒pCold TF-VP1成功转入大肠杆菌BL21感受态细胞,并以可溶性蛋白形式表达。经诱导表达在约82 ku处出现阳性条带。当重组菌株诱导条件为16 ℃、IPTG终浓度为1.2 mmol/L、诱导时间为3 h时,VP1蛋白表达量最高;经Western blotting分析,可在82 ku处出现明显条带。将VP1 蛋白与荧光微球偶联,阴性对照（背景）的平均荧光值为17（＜100）。测试孔的平均MFI为2 339.5（＞2 000）,证明SVA VP1蛋白与微球偶联成功,偶联成功的荧光微球可用于检测猪血清中SVA抗体的检测。【结论】本研究在大肠杆菌中成功表达并纯化了SVA VP1蛋白,初步建立了SVA抗体液相芯片检测方法,为后续研究奠定了基础。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2019,(8)
为建立A型塞尼卡病毒(SVA)血清学检测方法,本研究根据GenBank中SVA基因序列设计引物,PCR扩增其VP1基因,将目的片段克隆于p ET-32a(+)表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3+)中诱导表达。利用纯化的重组VP1 (rVP1)蛋白作为包被抗原,通过矩阵法优化ELISA反应条件,初步建立了SVA的间接ELISA抗体检测方法。对该方法的特异性、敏感性和重复性进行检测;利用该方法对43份背景清晰的猪血清进行检测,并与中和试验结果进行比较;同时对205份临床猪血清样品进行检测。结果显示,本研究正确表达了约51.0 ku的可溶性重组蛋白,western blot试验表明纯化的r VP1蛋白具有良好的反应原性,以r VP1蛋白建立了间接ELISA方法。特异性试验结果显示该ELISA方法可以检测SVA抗体,而与FMDV (O/A/Asia I)、 PEDV、 PCV2、PRRSV、PRV等病原的抗血清均无交叉反应;敏感性试验结果显示样品经1∶800倍稀释后折OD450nm值仍大于临界值;批内、批间的重复性试验变异系数均小于10%,具有较好的重复性和稳定性。43份猪血清样品的检测结果与中和试验符合率为93.02%。205份临床猪血清样品的阳性检出率为5.37%。本研究为SVA血清学检测提供了技术手段。 相似文献
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为获得可用于鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体检测的重组抗原VP2蛋白,根据GenBank中发表的IBDV VP2序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术克隆IBDV经典标准攻毒株(BC6/85株)的VP2基因,插入质粒pET-32a中构建重组表达质粒pET-32a-VP2,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后,Western-blot检测表明具有良好的反应原性。本研究为下步建立IBDV抗体的间接ELISA方法及新型疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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虎源猫泛白细胞减少症病毒VP2基因的原核表达及其抗原特性 总被引：1，自引：0，他引：1
利用PCR技术从虎源猫泛白细胞减少症病毒(FPV)HLJ株细胞培养物中扩增VP2基因,测序后插入原核表达载体pGEX-6p-1构建pGEX-6p-VP2重组质粒,转化BL21(DE3)中进行诱导表达。表达蛋白经切胶法纯化,所得产物用Western blot法检测其抗原活性。以纯化的重组VP2蛋白作为抗原,通过建立检测家猫FPV自然感染抗体的间接ELISA方法来研究该蛋白作为猫科动物猫泛白细胞减少症通用诊断抗原的特性。测序结果显示:该基因全长1755bp,编码584个氨基酸。SDS-PAGE和Western blot显示表达产物以包涵体形式存在,大小约为84000(其中目的蛋白58000,GST标签26000),并具有抗原性。间接ELISA抗体检测法的应用结果显示表达的重组VP2蛋白可以作为诊断抗原用于家猫FPV自然感染抗体的间接ELISA检测。并初步证明该蛋白具有作为猫科动物猫泛白细胞减少症通用诊断抗原的特性。 相似文献
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A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)感染主要引起猪群水泡性疾病,该病临床症状与其他水泡性疾病较难区分。本研究通过RT-PCR检测发现广东某规模化猪场发生的水泡性疾病为SVA感染。通过在HEK293T细胞上进行病毒分离,成功获得了一株SVA毒株并命名为SVA/China/KP-01-2017 (KP-01)。KP-01第2代即能引起HEK 293T细胞明显的细胞病变。该毒株多聚蛋白基因长6 546 nt,编码长2 181 aa的多聚蛋白。同源性及遗传进化分析表明,该毒株与国内外分离的毒株相似性较高,与Colombia/Co-01/2016株在遗传距离较近。本研究成功分离1株SVA,为SVA深入研究奠定了基础。 相似文献
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《动物医学进展》2020,(6)
为探究水貂细小病毒(MEV)VP2蛋白的结构和功能,对MEV VP2蛋白进行原核表达并纯化,用ELISA初步评价重组蛋白在血清学诊断中的价值。通过大肠埃希菌表达外源基因的方法构建MEV VP2原核表达体系,经诱导表达得到以包涵体形式存在的目的蛋白,对蛋白进行纯化、透析复性并鉴定;加入分子伴侣pTf16质粒构建共表达系统,优化表达条件以提升可溶性目的蛋白的表达量,对表达产物进行纯化及鉴定。将纯化后的可溶性蛋白、复性后的包涵体蛋白及纯化后的全病毒蛋白作为抗原包被酶标板,用间接ELISA方法对MEV标准阴、阳性血清进行检测,初步对比评价3种抗原的血清学诊断价值。结果表明,经过双酶切和测序鉴定,成功构建重组蛋白原核表达载体;重组VP2蛋白的分子质量约为67ku;优化诱导温度和诱导试剂浓度未能解决包涵体表达问题;构建了共表达系统,优化表达条件后可溶性目的蛋白的表达量得到明显提高;SDS-PAGE和Western blot鉴定结果表明,两种重组蛋白皆具有良好的反应原性;间接ELISA结果表明可溶性表达蛋白更适合作为MEV的候选诊断抗原。通过分子伴侣共表达和包涵体蛋白复性的方法获得了大量有活性的目的蛋白,为建立水貂细小病毒血清学诊断方法和制备MEV病毒样颗粒(VLPs)及VP2蛋白多克隆抗体奠定了基础。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2020,(14)
为了建立一种检测A型塞内卡病毒(SVA)VP2蛋白抗体的阻断ELISA方法,试验用SVA VP2蛋白作为抗原包被酶标板,采用棋盘法确定最佳蛋白包被浓度和单克隆抗体最佳稀释倍数。同时对阻断ELISA的其他条件(封闭液、血清稀释度、底物反应条件)进行优化,对方法的特异性和重复性进行考察。结果表明:VP2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL;最佳封闭液为2%BSA,每孔200μL,37℃封闭1 h;待检血清最佳稀释度为1∶1,在37℃条件下作用1 h;单克隆抗体最佳稀释度为1∶40 000,在37℃条件下作用1 h;底物最佳反应条件为室温避光10 min。特异性试验结果显示,SVA阳性血清与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综征病毒、猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应。批间、批内重复性试验结果的变异系数均小于10%。对200份猪血清样本进行荧光抗体中和试验和阻断ELISA方法检测,符合率为96.0%。说明该ELISA方法具有良好的特异性和重复性,可用于塞内卡病毒血清抗体检测和流行病学调查。 相似文献
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A型塞内卡病毒(SVA)是近年来新流行的一种传染性病原，与口蹄疫病毒(FMDV)具有相似的基因组结构，所致临床症状也十分相似。为了研发一种新型的基因工程活载体疫苗，用于预防塞内卡病毒感染和口蹄疫，以SVA全长感染性克隆pSVA-GX01为基础，在SVA 2A与2B基因之间插入O型FMDV的VP1基因，经双酶切及测序鉴定，成功获得了重组质粒pSVA-FMDV-VP1-O。将重组质粒转染BHK-21细胞，拯救获得重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O,间接免疫荧光试验鉴定显示，该重组病毒可在细胞中表达O型FMDV的VP1蛋白。对该重组病毒进行体外生长增殖特性以及遗传稳定性分析表明，重组毒株和亲本毒株在BHK-21细胞上具有相似的增殖特性，插入的FMDV VP1基因可在细胞传代过程中稳定存在6代。研究结果为开发以塞内卡病毒为载体构建表达口蹄疫病毒VP1蛋白的重组基因工程活载体疫苗提供了参考。 相似文献
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目前在昆虫杆状病毒表达系统（baculovirus expression vector system,BEVS）中表达A型塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）结构蛋白VP1尚未见报道。本研究将VP1基因通过限制性酶切位点插入杆状病毒载体pFastBac I,然后将鉴定正确的重组载体转化至DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选,对鉴定正确的菌落提取质粒。将质粒转染Sf9昆虫细胞,待有明显细胞病变后收获重组杆状病毒rBac-I-VP1,并进行病毒滴度测定。随后通过蛋白免疫印记（Western Blot）和间接免疫荧光（IFA）鉴定VP1蛋白表达情况。结果显示,重组杆状病毒rBac-I-VP1滴度为6.8×105 pfu/mL;Western Blot可检测到相对分子质量约27 kDa的表达产物,且其能够被SVA兔阳性多克隆血清识别;IFA试验显示,VP1蛋白能够在Sf9细胞内表达。结果表明,本研究利用BEVS表达的SVA VP1蛋白具有良好的免疫反应性,为其后期功能研究及SVA诊断试剂研制提供了技术基础。 相似文献
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为获得活性良好的兔出血症病毒基因工程抗原,本研究对兔出血症病毒ZB分离株的VP60基因进行了原核表达与初步应用。参照ZB株分离病毒VP60基因序列,设计合成一对特异性引物,PCR扩增长876bp的VP60基因片段。将目的片段定向克隆至pET30a表达载体中,经鉴定正确后,重组质粒转化BL21表达菌,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白,重组蛋白纯化后,Western blot检测表明具有良好的抗原性与特异性,以该蛋白作为诊断抗原,初步建立了检测兔瘟病毒抗体的间接ELISA诊断方法。本研究为RHDV分子流行病学调查提供了参考,为VP60蛋白结构与功能研究、RHDV抗体检测试剂盒及新型疫苗的研制奠定基础。 相似文献
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《畜牧兽医学报》2020,(4)
本研究旨在明确塞内卡病毒A(Senecavirus A, SVA)FJLY株的基因组特性及其与其他毒株的同源性关系,并了解SVA-FJLY株的致病性。以分离自福建省某养殖场中的一株SVA-FJLY株为研究对象,参照其原型毒株SVV-001(GenBank No.DQ641257.1)全基因组序列设计5对引物,通过RT-PCR扩增、测序、拼接,获得SVA-FJLY株全基因组序列并进行序列分析;并通过滴鼻攻毒3～4周龄仔猪。结果表明,SVA-FJLY株基因组全长7 275 bp(不包括PolyA),SVA-FJLY株基因组存在一个多聚蛋白、VP1蛋白和VP2蛋白。SVA-FJLY株与参考毒株之间的基因组一级结构有较高的相似性,与HeB01-2017株(MF967574.1)相似性最高,达98.5%;而与SVA原型毒株SVV-001株(DQ641257.1)的相似性较低,为93.9%。SVA-FJLY株与国内几个毒株属于同一个分支,与国内的HeB01-2017株亲缘关系最近,同时与国外Colombia-2016株(KX857728.1)的亲缘关系最近。通过动物试验发现试验组猪攻毒10 d后,试验组2/3发病,对照组3/3正常,未出现仔猪死亡。通过全基因组序列测定获得了SVA-FJLY株全基因组序列并进行序列分析,明确SVA-FJLY株的基因组特性及其与其他毒株的相似性关系,了解了SVA-FJLY株的致病性,为SVA的反向遗传学和疫苗的研制提供参考依据,同时也丰富了SVA的基因组信息数据库。 相似文献