共查询到20条相似文献，搜索用时 31 毫秒
1.
2.
《畜牧与兽医》2021,(8)
旨在解决大肠杆菌表达系统对禽腺病毒血清4型(FAdV-4) Fiber-2蛋白进行表达时存在的多包涵体问题。通过添加不同的化学伴侣分子来提升Fiber-2的可溶性表达量,并进一步通过动物试验评价蛋白的免疫原性。结果显示,添加化学伴侣分子β-环糊精显著提高了Fiber-2的可溶性表达量,且重组蛋白与FAdV-4阳性血清具有良好的反应性,琼脂扩散(AGP)效价达1∶128;以表达的可溶性Fiber-2蛋白作为抗原,制备油乳剂疫苗并免疫SPF鸡,通过AGP检测免疫后血清中针对FAdV的特异性抗体水平,结果Fiber-2蛋白疫苗及FAdV-4全病毒灭活疫苗于免疫后14 d,均可诱生特异性的AGP抗体。以上结果表明β-环糊精显著提高了Fiber-2的可溶性表达量,且免疫原性良好。本研究为FAdV-4亚单位疫苗的研制及产业化奠定了基础。 相似文献
3.
为了获得鸭源血清4型禽腺病毒(FAdV-4)重组Hexon蛋白,并掌握重组蛋白的免疫学活性和应用前景,试验采用PCR方法、原核表达技术、Western-blot检测和间接ELISA方法对鸭源FAdV-4 Hexon蛋白的主要抗原区域进行截短表达、鉴定与初步应用研究。结果表明:PCR方法扩增得到大小为1 011 bp的FAdV-4 Hexon主要抗原区域基因;将目的片段定向克隆至pET-30a(+)原核表达载体,经IPTG诱导获得以包涵体形式表达的重组蛋白;重组蛋白变性纯化后进行Western-blot检测,其可与FAdV-4阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫学活性;以纯化蛋白为包被抗原,初步建立检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法,用该方法进行检测,FAdV-4灭活疫苗免疫鸭场的免疫合格率为96.46%,FAdV-4感染鸭场的阳性感染率为99.46%,无FAdV-4免疫史和感染史鸭场的阳性感染率为0。说明试验获得了具有良好生物学活性的FAdV-4 Hexon重组蛋白。 相似文献
4.
【目的】 研究针对新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)和禽腺病毒(Fowl adenovirus, FAdV)的耐热基因工程疫苗。【方法】 利用反向遗传学操作技术将NDV耐热株的HN基因替换到LaSota疫苗株上, 再将禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4, FAdV-4)的Fiber2基因插入到其基因组上, 构建表达Fiber2蛋白的重组耐热NDV质粒pTS-HN-Fiber2。通过病毒拯救技术拯救重组NDV rTS-HN-Fiber2, 并测定其生物学特性和作为疫苗候选株的免疫原性和攻毒保护性。【结果】 rTS-HN-Fiber2的鸡胚平均致死时间>168 h, 且脑内接种致病指数为0, 属于弱毒的范畴; 在细胞上的生长曲线结果表明, rTS-HN-Fiber2与亲本LaSota株有相似的生长曲线, 但最终的生长滴度略低于LaSota株; rTS-HN-Fiber2在56 ℃处理15 min后, 病毒滴度下降约103 TCID50/mL, 而LaSota株56 ℃处理5 min几乎无感染性; 间接免疫荧光试验结果表明, rTS-HN-Fiber2能表达Fiber2蛋白。免疫和攻毒试验结果显示, rTS-HN-Fiber2能产生NDV抗体, 且能显著提高雏鸡在FAdV-4强毒下的存活率, 减轻FAdV-4强毒引起的组织病变, 降低组织中的病毒载量。【结论】 本研究成功构建了表达FAdV-4 Fiber2蛋白的重组耐热NDV, 该病毒保持了亲本LaSota株的弱毒生物学特性, 但热稳定性有显著提升; 重组NDV免疫雏鸡可产生针对NDV和FAdV-4强毒的保护, 该重组NDV可作为开发针对FAdV-4和NDV二联基因工程疫苗的候选病毒株。 相似文献
5.
为进一步研究鸭腺病毒3型（DAdV-3）Fiber-2蛋白，研究通过PCR扩增fiber-2基因，构建p ET32a-DAdV3-fiber2原核质粒，表达并纯化蛋白，以纯化的蛋白为免疫原，免疫6周龄雌性BALB/c小鼠制备抗Fiber-2单克隆抗体杂交瘤细胞，采用间接免疫荧光试验和免疫印迹试验进行鉴定，并用于DAdV-3 Fiber-2杆状病毒表达产物的鉴定。结果显示：原核表达获得1.77 mg/mL Fiber-2蛋白，筛选获得2株阳性单克隆细胞株2E10E4和4F7F10，两株单克隆抗体均为IgG 1型，轻链类型为κ；DAdV-3感染的LMH细胞中存在特异性荧光，免疫印迹试验确认在约59 ku处出现特异性条带；采用制备的单克隆抗体确认了表达Fiber-2蛋白的重组杆状病毒。研究获得了针对DAdV-3 Fiber-2蛋白的单克隆抗体，为深入探究Fiber-2在DAdV-3感染机制中的作用以及为建立DAdV-3抗原免疫测定技术奠定了基础。 相似文献
6.
【目的】原核表达禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)Hexon蛋白,并制备兔抗Hexon多克隆抗体,为FAdV-4 Hexon功能研究提供材料。【方法】采用基于PCR的长DNA序列准确合成(PCR-based accurate synthesis, PSA)方法,设计全长拼接引物,在引物两端各设计保护性碱基合成FAdV-4 Hexon基因;利用同源重组技术将其连接至pCzn1-Hexon表达载体,获得pCzn1-Hexon重组质粒进行原核表达,采用纯化重组蛋白免疫新西兰白兔制备兔抗Hexon蛋白的多克隆抗体。以间接ELISA方法测定多克隆抗体效价;通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定多克隆抗体的特异性。【结果】重组原核表达质粒pCzn1-Hexon经双酶切及测序鉴定证明构建正确;获得的重组蛋白以包涵体的形式表达,分子质量约为41 ku;用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔后,通过间接ELISA方法检测抗体效价高达1∶512 000。以制备的多克隆抗体为一抗,通过Western blotting和IFA检测到鸡肝... 相似文献
7.
禽腺病毒血清4型Fiber2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定 总被引：2，自引：1，他引：1
旨在制备禽腺病毒血清4型（FAdV-4）纤突蛋白（Fiber2）的特异性单克隆抗体（MAb）,本研究将原核表达的可溶性重组蛋白NusA-Fiber2作为免疫原免疫BALB/c雌鼠,筛选获得3株能稳定分泌抗FAdV-4 Fiber2蛋白MAb的杂交瘤细胞株2G5、2G8、4C2,取细胞株2G5制备腹水并纯化,利用间接免疫荧光试验（immunofluorescence assay,IFA）和Western blot鉴定该单抗的特异性。用制备的单抗包被酶标板,通过一系列的优化,建立了FAdV-4 Fiber2双抗夹心ELISA检测方法。通过逐步截短分析鉴定出单克隆抗体识别的抗原表位区域。结果表明：成功获取3株单克隆细胞株2G5、2G8、4C2。MAb 2G5可与原核表达纯化的Fiber2蛋白及FAdV-4特异性反应。建立的双抗夹心ELISA检测方法具有很好的特异性、灵敏性和重复性。该MAb识别的表位序列是N端aa1—33。本研究成功制备了具有良好Western blot和IFA反应原性的单克隆抗体,为Fiber2蛋白功能研究和FAdV-4新型表位疫苗商品化研发奠定了基础。 相似文献
8.
1群4型禽腺病毒的分离鉴定及Fiber-2蛋白的免疫效果分析 总被引：2，自引：0，他引：2
旨在鉴定河南某蛋鸡场以心包积液、肝肿大出血为特征的病原,并对病原的免疫原性蛋白进行表达和效果分析。本研究采用病毒分离、血清学试验、PCR检测及测序分析、动物回归试验、大肠杆菌表达、蛋白纯化、攻毒保护等方法进行研究。结果显示,所采集样品经卵黄囊途径接种7日龄SPF鸡胚,盲传2代后获得病毒;PCR可扩增出约900 bp的Hexon基因片段,经测序,其Hexon基因与血清C4型毒株的相似性为100%;血清中和试验结果表明分离的禽腺病毒为1群血清4型禽腺病毒,命名为HN-ZK株。该毒株可在鸡胚原代肝细胞上产生CPE,病毒含量可达107.5TCID50·0.1 mL-1。动物回归试验表明,该分离毒株可使35日龄SPF鸡100%（10/10）表现出发病症状。以分离株的DNA为模板,利用大肠杆菌原核表达系统,获得相对分子质量约为33 ku的Fiber-2蛋白,离心浓缩、纯化后蛋白含量为300 mg·mL-1。将表达的Fiber-2蛋白用不同的剂量免疫SPF鸡,结果表明20 μg·只-1的剂量能使鸡完全抵抗强毒株的攻击,说明Fiber-2蛋白具有较好的免疫原性。本研究可为禽心包积水-肝炎综合征的诊断和基因工程亚单位疫苗的研制提供数据参考。 相似文献
9.
血清4型禽腺病毒W株的分离鉴定和全基因组序列分析 总被引：1，自引：1，他引：0
为了解血清4型禽腺病毒(fowl adenovirus genotype 4,FAdV-4)W株全基因序列、结构特征及遗传变异情况,本试验采集发病鸡肝脏和肾脏进行PCR鉴定、SPF鸡胚和鸡胚肝细胞分离、电镜观察证明该病毒为FAdV-4,TCID_(50)为10~(-7.2)/0.1 mL;电镜观察可见70 nm左右的二十面体无囊膜病毒颗粒;经绒毛尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚后能明显抑制鸡胚发育出现侏儒胚,接种10 d内死亡率达100%;进一步对W株进行全基因组扩增及序列分析。病毒序列分析结果显示,其全基因组长为43 591 bp,共有60个开放阅读框,W株与GenBank中公布的FAdV-4参考毒株全基因组核苷酸序列同源性为98.4%～100%,其中与标准株非致病性毒株ON1(登录号:GU188428.1)的同源性为98.4%,主要缺失ORF19(脂肪酶基因)和ORF27;通过对病毒主要结构蛋白Hexon、Fiber-1和Fiber-2基因分析发现,W株与近几年国内分离株亲缘关系较近,与ON1株及其他国外分离株差异较大。综上说明,该分离株具有高致病性,与国外分离株存在较大差异,为进一步分析FAdV-4的毒力增强机制提供了基础依据。 相似文献
10.
【目的】探究副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)外膜蛋白lpxM的免疫原性,为预防鸡传染性鼻炎提供理论参考。【方法】构建pET-28a-lpxM原核表达载体,经PCR扩增和双酶切鉴定后将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,并对诱导时间和诱导浓度进行优化,用尿素缓冲液纯化重组蛋白lpxM并进行SDS-PAGE分析。利用Western blotting鉴定重组蛋白的特异性。将重组蛋白与MONTANIDEISA 71 VG佐剂制备成疫苗v-lpxM,通过动物试验观察重组蛋白的免疫效果。【结果】重组质粒pET-28a-lpxM转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后成功表达,在37 ku处有目的蛋白特异性条带,在37℃、700 mmol/L IPTG、诱导4 h时蛋白表达量最高;重组蛋白lpxM在上清和沉淀中均有表达,且在沉淀中表达量相对较高;Western blotting结果显示,C型副鸡禽杆菌Modesto株的阳性鸡血清与纯化后的重组蛋白可发生免疫反应。免疫保护试验结果显示,v-lpxM疫苗对A、B和... 相似文献
11.
12.
将鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒MY株Vp1基因原核表达工程菌(pET32a+Vp1,BL21(DE3)PlysS)对基因Yp1进行大量表达和纯化,得到鸭甲肝弱毒MY株Vp1重组蛋白作为抗原制备亚单位疫苗,免疫雏鸭,用间接ELISA检测方法对免疫后抗体生成水平进行监测,并通过动物攻毒试验评价免疫保护效果.结果显示:Vp1重组蛋白免疫家兔后血清检测琼扩效价≥1∶64,细胞中和试验效价为1/45;雏鸭免疫后抗体生成水平呈明显上升趋势,对攻毒起到了保护作用.首次揭示了DHAV-1结构蛋白Vp1刺激机体产生抗体使雏鸭获得保护的能力. 相似文献
13.
《畜牧与兽医》2020,(10)
为了制备禽腺病毒血清4型(FAdV-4)纤突蛋白1(Fiber 1)的多克隆抗体并对其特异性进行鉴定,将FAdV-4感染的病死鸡组织中扩增得到的Fiber 1基因构建到原核表达质粒pCold I,获得pCold I-Fiber 1表达质粒;然后将其转入大肠杆菌Rosetta(DE3)表达菌株中,加入1 mmol/L IPTG分别于16和37℃条件下诱导表达,SDS-PAGE检测结果显示重组蛋白Fiber 1以包涵体的形式成功表达,分子质量约53 kDa。表达蛋白纯化后免疫新西兰白兔,制备得到兔源Fiber 1蛋白的多克隆抗体。Western blot检验结果表明制备的Fiber 1阳性血清1∶1 000倍稀释时具有良好的反应性,间接免疫荧光试验测得多抗血清在1∶3 000倍稀释时,仍具有较好的活性且特异性良好。本研究为后续FAdV-4检测方法的开发及其相关致病机制的研究奠定了物质基础。 相似文献
14.
《中国家禽》2017,(19)
近年血清4型禽腺病毒(Serotype 4 fowl adenovirus,FAdV-4)在国内鸡群流行,给养鸡业带来了巨大经济损失。目前尚无针对FAdV-4特异性单克隆抗体的制备及其应用报道。研究通过将FAdV-4全病毒免疫小鼠,以纤突蛋白2原核表达产物为筛选抗原,研制出了4株针对FAdV-4的单克隆抗体,分别命名为3C2、4A6、5C4、5H6。间接免疫荧光试验证明4株单克隆抗体不与所检测的血清8型禽腺病毒反应,也不与FAdV-4的纤突蛋白1反应,仅与FAdV-4的纤突蛋白2反应,并且单克隆抗体3C2在体外能有效抑制FAdV-4的感染。4株抗FAdV-4纤突蛋白2单克隆抗体的成功获得为研制FAdV-4快速诊断试剂盒及探究纤突蛋白2在FAdV-4致病机制中的作用奠定了基础。 相似文献
15.
《中国兽医学报》2019,(9):1697-1702
利用NDV LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统,将禽腺病毒4型(FAdV-4)中国流行株的全长Fiber2基因插入到NDV基因组的P和M基因之间,构建并拯救出重组病毒rLaSota-Fiber2。利用RT-PCR和序列测定,以及Western blot对重组病毒进行了鉴定。结果显示,Fiber2基因插入位置和方向正确,Fiber2蛋白得到正确表达,表达形式为可溶的游离形式而非嵌入到NDV颗粒中。第10代重组病毒的鸡胚致病性试验和在鸡胚中的生长特性研究结果显示,重组病毒的半数鸡胚感染量(EID_(50))最高可达10~(8.5)/100μL,鸡胚平均致死时间(MDT)为120 h, 1日龄雏鸡脑内接种指数(ICPI)和6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)均为0,重组病毒保持了LaSota弱毒疫苗亲本毒株的低致病特性和对鸡胚良好的高滴度生长适应性。重组病毒与亲本LaSota株生长滴度在相近时间达到峰值,生长动力学特性与亲本株无明显差异。本试验构建的表达FAdV-4中国流行株Fiber2基因的重组病毒rLaSota-Fiber2有望为同时防控NDV和FAdV-4的感染提供安全、廉价和高效的辅助工具。 相似文献
16.
《中国兽医杂志》2017,(5)
为研究禽腺病毒4型重组鞭毛-fiber2蛋白免疫保护性,将鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白基因与禽腺病毒4型的fiber2基因融合,再将融合基因和单独的fiber2基因分别克隆到原核表达载体p ET-28a,后将构建的p ET-28a-flagellin-fiber2和p ET-28a-fiber2重组载体分别转入大肠杆菌BL21细胞,经IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE和Western Blot鉴定表达产物,再将表达产物纯化后免疫21日龄SPF鸡;结果表明,重组菌在37℃培养条件下1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h可表达最多的可溶性重组蛋白,Western Blot分析表明,所表达的重组蛋白均能与禽腺病毒血清4型感染阳性血清发生特异性反应,说明所表达蛋白具有良好反应原性,动物试验表明,表达的两种目的蛋白能为鸡提供一定保护力,且低剂量的重组鞭毛-fiber2蛋白产生较好的免疫保护效果。 相似文献
17.
血清4型禽腺病毒W株的分离鉴定和全基因组序列分析 总被引：1，自引：1，他引：0
为了解血清4型禽腺病毒（fowl adenovirus genotype 4,FAdV-4） W株全基因序列、结构特征及遗传变异情况,本试验采集发病鸡肝脏和肾脏进行PCR鉴定、SPF鸡胚和鸡胚肝细胞分离、电镜观察证明该病毒为FAdV-4,TCID50为10-7.2/0.1 mL;电镜观察可见70 nm左右的二十面体无囊膜病毒颗粒;经绒毛尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚后能明显抑制鸡胚发育出现侏儒胚,接种10 d内死亡率达100%;进一步对W株进行全基因组扩增及序列分析。病毒序列分析结果显示,其全基因组长为43 591 bp,共有60个开放阅读框,W株与GenBank中公布的FAdV-4参考毒株全基因组核苷酸序列同源性为98.4%~100%,其中与标准株非致病性毒株ON1（登录号：GU188428.1）的同源性为98.4%,主要缺失ORF19（脂肪酶基因）和ORF27;通过对病毒主要结构蛋白Hexon、Fiber-1和Fiber-2基因分析发现,W株与近几年国内分离株亲缘关系较近,与ON1株及其他国外分离株差异较大。综上说明,该分离株具有高致病性,与国外分离株存在较大差异,为进一步分析FAdV-4的毒力增强机制提供了基础依据。 相似文献
18.
鸡CD4基因片段原核表达及其单抗制备 总被引：1，自引：0，他引：1
将PCR扩增的鸡CD4基因片段克隆到pET-32a原核表达载体,构建获得原核表达重组载体pET-32a-CD4.重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3),经过IPTG诱导表达,Ni-NTA亲和树脂纯化获得融合蛋白His-CD4.以此融合蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤细胞技术制备了1株能够稳定传代并分泌抗CD4多肽单抗的杂交瘤细胞株,命名为3E12.经检测该抗体亚类为IgG2b,单抗腹水的间接ELISA效价为1:105,Western blot结果显示单抗与CD4多肽能特异性地结合. 相似文献
19.
《中国预防兽医学报》2019,(8)
为建立一种快速监测鸡群中血清4型禽腺病毒(FAdV-4)的方法,本研究通过PCR扩增FAd V-4 AQ强毒株的fiber-2基因截短体(112 bp～1 440 bp),克隆至p ET-32a(+)载体中进行原核表达,以重组表达的Fiber-2蛋白作为包被抗原,经优化反应条件,建立了快速检测FAd V-4的间接ELISA方法,该方法特异性试验结果显示,除FAd V-4外,与其它病原无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法检测血清最低稀释度为1∶12 800,具有较高的敏感性;重复性试验结果显示,该方法批内、批间变异系数均小于10%。该方法对FAd V-4临床感染的阳性血清检出率为100%,与琼脂扩散试验结果完全吻合。本研究建立的以Fiber-2重组蛋白为包被抗原的间接ELISA方法能够用于FAd V-4灭活疫苗免疫后的血清学调查。 相似文献
20.
为开展禽腺病毒4型(FAdV-4)五邻体蛋白(Penton)和纤丝蛋白(Fiber1)多克隆抗体的制备及评价,研究通过对Penton和Fiber1基因优势抗原表位基因片段进行生物信息学分析,设计特异性引物PCR扩增获得Penton和Fiber1优势抗原表位基因片段,将其克隆至原核表达载体pColdⅠ,转入表达宿主菌BL21(DE3)进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,将纯化、鉴定后的目的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,对抗体进行Western blot鉴定及间接ELISA抗体效价测定。结果可见,FAdV-4 Penton基因序列共编码525个氨基酸,Fiber1基因序列共编码432个氨基酸,其优势抗原表位点分别有7、6个区域,且均集中于N端;成功构建pColdⅠ-P和pColdⅠ-F1重组原核表达质粒,其诱导表达的重组蛋白Penton和Fiber1均与His标签单抗发生特异性反应,动物免疫获得的Penton、Fiber1多克隆抗体均能与目的蛋白反应形成特异性条带,且Penton多克隆抗体效价高于Fiber1多克隆抗体。综上,研究获得的纯化重组蛋白Penton较Fiber... 相似文献