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1.
猪流行性腹泻病毒CZ2014株的分离鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
2014年江苏某规模猪场发生腹泻疫情,采集发病仔猪小肠组织及肠内容物,经RT-PCR检测,仅猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性。将病料接种Vero细胞,盲传3代后,出现明显的细胞合胞体病变,细胞空泡化,最终裂解脱落。将细胞反复冻融后,收获病毒,经RT-PCR以及间接免疫荧光(IFA)鉴定后,确认所收获的病毒为PEDV,将该分离毒株命名为CZ2014株(Gen Bank:KT428878.1)。RT-PCR扩增其S基因,序列分析结果表明,CZ2014株S基因序列与近年来流行的毒株同源性较高,而与经典疫苗毒株同源性较低。PEDV流行毒株的分离为该病毒致病机制研究及其防控奠定了基础。 相似文献
2.
为了确定临床病例的致病原,并掌握该致病原的生物学特性,试验采用PCR检测、病毒分离培养与细胞病变观察、PCR分型鉴定、间接免疫荧光试验、中和试验、生物学特性检测等方法对临床病料样品进行研究。结果表明:病料样品经牛病毒性腹泻病毒(BVDV)特异性引物检测为阳性,病料样品可引起MDBK细胞出现典型的圆缩、拉网等细胞病变现象,PCR分型鉴定中分离毒株经BVDV-1特异性引物检测为阳性,间接免疫荧光试验中分离毒株可引起MDBK细胞出现特异性荧光,中和试验中分离毒株可被BVDV阳性血清特异性中和,分离毒株的TCID_(50)为1×10~(-5.61)/0.1 mL,对5-氟脱氧尿核苷不敏感,对乙醚、氯仿、胰蛋白酶等敏感,对酸性敏感,对碱性不敏感,54℃1 h可灭活。说明临床病例的致病原为藏羊源BVDV毒株。 相似文献
3.
猪流行性腹泻病毒分离鉴定及其灭活疫苗免疫保护效果研究 总被引：5，自引：0，他引：5
为筛选能用于猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗研发的流行毒株,收集PEDV阳性病料,以Vero细胞进行病毒分离试验,并对分离毒株进行外源病毒检测、病毒培养特性研究、仔猪毒力试验及免疫效力试验等。9份PEDV阳性病料共分离到3株病毒,分别命名为PEDV-SC12、PEDV-JS12、PEDV-JX12。其中PEDV-SC12株存在支原体污染;PEDV-JS12株与PEDV-JX12株均能被PEDV特异性阳性血清中和;PEDV-JS12株能在Vero细胞上增殖并产生细胞病变,但适应细胞45代以后病毒培养效价仍然偏低;PEDV-JX12滴度能维持在106.0 TCID50/mL以上。PEDV-JX12株毒力试验显示,该分离株能够通过人工感染复制出腹泻病例,并能从发病动物体内检测到感染的病毒。免疫攻毒保护试验显示,以PEDV-JX12株制备的灭活疫苗免疫母猪,对所产仔猪攻毒后免疫组6.25%(1/16)发病,对照组100%(8/8)发病。说明PEDV-JX12株能够适应细胞培养,免疫接种母猪能给仔猪提供有效保护,可以用于PEDV流行毒株的疫苗研发。 相似文献
4.
为了解江苏省某规模化猪场猪流行性腹泻病毒(PEDV)遗传变异情况,本试验采集腹泻仔猪小肠组织及肠道内容物,通过RT-PCR进行PEDV鉴定。将检测为阳性的病料组织经20μg/mL胰酶处理后,接种到Vero细胞中进行培养,将细胞培养物进行反复冻融后,收获病毒液,进行RT-PCR鉴定。采用分段重叠策略对其S基因进行全基因序列扩增,并在此基础上分析该毒株S基因的核苷酸同源性及遗传进化关系。结果显示,经RT-PCR鉴定,病料组织呈PEDV阳性,阳性病料接种Vero细胞盲传4代后,出现明显的细胞病变,表现为细胞合胞体病变,空泡化,最终裂解脱落。收获的病毒液经RT-PCR鉴定后,确认分离到1株PEDV,命名为JS2017株。核苷酸序列分析表明,JS2017株S基因序列与美国变异株OH1414、加拿大变异株ON-007、中国变异株PEDV-LYG和CH/PDS/2015位于同一进化分支,其核苷酸同源性高达99.0%以上;其中与中国变异株YC2014亲缘关系最近,核苷酸同源性为100.0%;与经典株CV777、DR13株同源性较低,亲缘关系较远。结果表明,本研究分离获得的JS2017毒株是一株PEDV地方流行变异毒株,与2014年中国江苏分离株(YC2014株)亲缘关系最密切,与当前猪流行性腹泻疫苗株亲缘关系较远。 相似文献
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为了解江苏省某规模化猪场猪流行性腹泻病毒(PEDV)遗传变异情况,本试验采集腹泻仔猪小肠组织及肠道内容物,通过RT-PCR进行PEDV鉴定。将检测为阳性的病料组织经20μg/mL胰酶处理后,接种到Vero细胞中进行培养,将细胞培养物进行反复冻融后,收获病毒液,进行RT-PCR鉴定。采用分段重叠策略对其S基因进行全基因序列扩增,并在此基础上分析该毒株S基因的核苷酸同源性及遗传进化关系。结果显示,经RT-PCR鉴定,病料组织呈PEDV阳性,阳性病料接种Vero细胞盲传4代后,出现明显的细胞病变,表现为细胞合胞体病变,空泡化,最终裂解脱落。收获的病毒液经RT-PCR鉴定后,确认分离到1株PEDV,命名为JS2017株。核苷酸序列分析表明,JS2017株S基因序列与美国变异株OH1414、加拿大变异株ON-007、中国变异株PEDV-LYG和CH/PDS/2015位于同一进化分支,其核苷酸同源性高达99.0%以上;其中与中国变异株YC2014亲缘关系最近,核苷酸同源性为100.0%;与经典株CV777、DR13株同源性较低,亲缘关系较远。结果表明,本研究分离获得的JS2017毒株是一株PEDV地方流行变异毒株,与2014年中国江苏分离株(YC2014株)亲缘关系最密切,与当前猪流行性腹泻疫苗株亲缘关系较远。 相似文献
6.
《中国畜牧兽医》2018,(11)
本研究旨在获得猪流行性腹泻病毒(PEDV)分离株,并对其致病性进行研究。应用Vero细胞从山东某猪场腹泻病料中进行病毒分离,通过细胞病变、免疫荧光试验、电镜观察和RT-RCR进行鉴定,并对分离株的S基因序列进行分析;应用10~(3.5) TCID_(50)/mL分离株口服接种3日龄仔猪并观察临床症状和病理变化;用不同滴度的分离株分别口服接种3日龄仔猪(3mL/只),统计各组仔猪的死亡率,确定最小致死量。结果显示,成功分离到1株PEDV,命名为PEDV SD201604株。该分离毒株能在Vero细胞上增殖,产生细胞病变,传代至F6代时病毒滴度可达10~(3.5) TCID_(50)/mL,免疫荧光试验和RT-RCR检测均为PEDV阳性。电镜观察可见直径大小约为100nm的病毒粒子,有明显的囊膜和纤突,具有PEDV病毒粒子典型的形态特征,确定分离株为PEDV。S基因序列分析显示,分离株为国内流行的PEDV变异株。动物回归试验结果显示,口服感染该分离株的5头3日龄仔猪全部出现典型的PED临床症状和病理变化,其中3头死亡。最小致死量试验结果表明,口服感染3 mL病毒含量为10~(4.5) TCID_(50)/mL的分离株可使仔猪全部死亡。本试验结果可为PEDV的分离鉴定及生物学研究提供参考与借鉴。 相似文献
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为了解伪狂犬病病毒(PRV)变异情况，从山东和江苏两地的某发病猪场分别采集阳性病料接种BHK-21细胞，连续传代进行病毒分离，观察细胞病变；对细胞培养物进行间接免疫荧光与蛋白印迹鉴定，通过对病毒滴度的测定绘制了分离病毒株的一步生长曲线；进一步动物试验鉴定分离株的毒力，并对其gE基因进行遗传进化分析。结果显示：利用PCR成功扩增出PRV的gB、gC和gE特异性基因，病料接种BHK-21细胞后产生了特异性细胞病变；病毒感染细胞后表达了gE蛋白，并与抗PRV单抗特异性结合，显示成功分离到2株分离毒株，分别命名为SDWF2019和JSNT2019;通过序列分析，2个分离株与我国新流行的PRV毒株属于同一遗传进化分支。本研究为我国华东区猪伪狂犬病的疫情监测提供了参考。 相似文献
8.
《中国畜牧兽医》2015,(9)
为分离鉴定新疆地区牛病毒性腹泻—黏膜病病毒(BVDV)流行毒株,掌握该毒株的生物学特性,本试验在新疆北疆部分地区采集牛病毒性腹泻—黏膜病(BVD/MD)疑似病例的粪便,通过RT-PCR检测、细胞分离培养、间接免疫荧光抗体检测、免疫电镜观察及血清中和试验5种方法对毒株进行分离和鉴定。对毒株的TCID50测定后,再对毒株分别进行乙醚敏感性试验、氯仿敏感性试验、胰蛋白酶敏感性试验、酸碱度敏感性试验、温度敏感性试验及核酸分型试验等理化特性检测。经RT-PCR诊断,病料在286bp处出现了目的片段。将RT-PCR诊断为阳性的粪便,接种于密度约为80%的单层MDBK细胞出现了细胞病变,盲传5代至出现典型的细胞病变。将F5代细胞培养物采用间接免疫荧光抗体检测,结果产生了与C24V标准毒株相同的特异性黄绿色荧光。免疫电镜观察到了大量呈球形的BVDV粒子,大小20~40nm。血清中和试验中抗体阳性血清处理组细胞均未出现细胞病变,病毒完全被抗体阳性血清中和。综合以上方法确定分离株为BVDV毒株。对分离株进行毒价和理化特性测定,该毒株TCID50为10-4.5/0.1mL,对乙醚和氯仿敏感,对胰蛋白酶敏感,耐碱不耐酸,对温度敏感,经54℃1h完全被灭活,属于RNA病毒。本试验成功分离到一株新疆BVDV流行毒株,掌握了该毒株的生物学特性,为今后该病的诊断和防控奠定了基础。 相似文献
9.
为分离鉴定新疆地区牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)流行毒株,掌握该毒株的生物学特性,本试验在新疆北疆部分地区采集牛病毒性腹泻-黏膜病(BVD/MD)疑似病例的粪便,通过RT-PCR检测、细胞分离培养、间接免疫荧光抗体检测、免疫电镜观察及血清中和试验5种方法对毒株进行分离和鉴定。对毒株的TCID50测定后,再对毒株分别进行乙醚敏感性试验、氯仿敏感性试验、胰蛋白酶敏感性试验、酸碱度敏感性试验、温度敏感性试验及核酸分型试验等理化特性检测。经RT-PCR诊断,病料在286 bp处出现了目的片段。将RT-PCR诊断为阳性的粪便,接种于密度约为80%的单层MDBK细胞出现了细胞病变,盲传5代至出现典型的细胞病变。将F5代细胞培养物采用间接免疫荧光抗体检测,结果产生了与C24V标准毒株相同的特异性黄绿色荧光。免疫电镜观察到了大量呈球形的BVDV粒子,大小20~40 nm。血清中和试验中抗体阳性血清处理组细胞均未出现细胞病变,病毒完全被抗体阳性血清中和。综合以上方法确定分离株为BVDV毒株。对分离株进行毒价和理化特性测定,该毒株TCID50为10-4.5/0.1 mL,对乙醚和氯仿敏感,对胰蛋白酶敏感,耐碱不耐酸,对温度敏感,经54 ℃ 1 h完全被灭活,属于RNA病毒。本试验成功分离到一株新疆BVDV流行毒株,掌握了该毒株的生物学特性,为今后该病的诊断和防控奠定了基础。 相似文献
10.
为初步调查河北省邢台市及周边地区猪流行性腹泻(PED)分子流行病学情况，试验于2022年1月—12月从河北省邢台市及周边县(市、区)采集疑似感染PED猪肠道病料或新鲜粪便共206份，采用荧光定量PCR技术检测样品猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性率；同时采用RT-PCR法扩增部分PEDV阳性病料S1基因序列，根据S1基因序列特征分析毒株基因型和变异情况。结果显示：共47份样品为PEDV核酸阳性，平均阳性率为22.82%,其中腹泻仔猪、育肥猪和母猪样品PEDV检出率分别为27.05%、15.15%和20.83%;采用RT-PCR法共扩增6份PEDV阳性样品S1基因部分序列，进一步序列分析发现5个毒株属于PEDV变异株，1个毒株属于PEDV经典株。研究结果表明，河北省邢台市及周边地区PED流行情况较严重，且同时流行PEDV经典株和变异株，但PEDV变异株为优势基因型。 相似文献
11.
12.
《中国预防兽医学报》2016,(4)
为确定2014年河北某猪场哺乳仔猪群腹泻的病原,本研究从该发病猪场采集了22份临床样品,采用PCR方法进行腹泻病原的检测。结果显示其中17份样品为猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性,而猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)均为阴性。选取其中5份PEDV阳性样品在Vero细胞中进行病毒的分离,结果显示,仅一份样品在接种细胞24 h后即可观察到细胞病变。对病变细胞进行RT-PCR及间接免疫荧光鉴定均为PEDV阳性。将分离的病毒株命名为He B10/2014。将其在Vero细胞中传至F5代次后病毒增殖明显增快,病毒滴度于感染细胞24 h达到峰值。对分离株的S基因进行克隆和测序分析,结果显示该病毒分离株符合国内近年来流行病毒株S蛋白的变异特征,即在S蛋白中存在4个连续氨基酸的插入(~(59)QGVN~(62))和3个氨基酸的缺失(~(14)0N和~(163)NI~(164))。本研究结果表明分离获得的HeB10/2014株为国内近年来新的PEDV流行株。 相似文献
13.
猪流行性腹泻病毒SD201604株的分离鉴定及致病性研究 总被引：2，自引：2，他引：0
本研究旨在获得猪流行性腹泻病毒（PEDV）分离株,并对其致病性进行研究。应用Vero细胞从山东某猪场腹泻病料中进行病毒分离,通过细胞病变、免疫荧光试验、电镜观察和RT-RCR进行鉴定,并对分离株的S基因序列进行分析;应用103.5 TCID50/mL分离株口服接种3日龄仔猪并观察临床症状和病理变化;用不同滴度的分离株分别口服接种3日龄仔猪（3 mL/只）,统计各组仔猪的死亡率,确定最小致死量。结果显示,成功分离到1株PEDV,命名为PEDV SD201604株。该分离毒株能在Vero细胞上增殖,产生细胞病变,传代至F6代时病毒滴度可达103.5 TCID50/mL,免疫荧光试验和RT-RCR检测均为PEDV阳性。电镜观察可见直径大小约为100 nm的病毒粒子,有明显的囊膜和纤突,具有PEDV病毒粒子典型的形态特征,确定分离株为PEDV。S基因序列分析显示,分离株为国内流行的PEDV变异株。动物回归试验结果显示,口服感染该分离株的5头3日龄仔猪全部出现典型的PED临床症状和病理变化,其中3头死亡。最小致死量试验结果表明,口服感染3 mL病毒含量为104.5 TCID50/mL的分离株可使仔猪全部死亡。本试验结果可为PEDV的分离鉴定及生物学研究提供参考与借鉴。 相似文献
14.
为了解华中地区犬细小病毒2型(CPV-2)的流行趋势以及变异情况，本研究于2020年9月至2022年1月间采集华中地区的418份疑似感染犬细小病毒的粪便样品，通过PCR方法检测，利用F81细胞进行病毒分离、间接免疫荧光试验，并对分离病毒的VP2基因进行氨基酸序列及其同源性和遗传进化分析。结果显示，358份病料检测出CPV-2,阳性率为85.65%。病料接种F81细胞后，有23份阳性样品出现明显细胞病变，间接免疫荧光试验观察到明显荧光。VP2基因序列分析结果表明，分离毒株中有New-CPV-2a型12株、New-CPV-2b型5株、CPV-2c型6株。核苷酸同源性为97.9%～99.8%,氨基酸同源性为95.9%～100.0%。遗传进化分析结果显示，分离毒株与国内分离株、伊朗、巴西分离株亲缘关系较近，与意大利、日本、阿根廷分离株亲缘关系较远。本研究为华中地区犬细小病毒防控及研制高效疫苗奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2017,(5):769-775
为了分析猪流行腹泻病毒(PEDV)在山东地区的流行和遗传变异情况,对2013—2015年收集的临床腹泻样品,参照GenBank中已经发表的PEDV毒株的N基因序列,设计1对特异性引物,利用RT-PCR技术检测PEDV抗原,并对其中的16份阳性样品进行病毒分离与S1基因测序分析。将含有PEDV流行株S1基因其中1个抗原表位(83~276aa)的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合技术,筛选获得2株针对PEDV S蛋白抗原表位的杂交瘤细胞,其中1株(1E5)可以区分PEDV经典毒株和流行毒株。临床检测结果表明:PEDV临床检出率由2013年的57.8%提高到2015年的75.68%,PEDV在山东地区的发病季节除春冬季节,近年夏季也呈高发趋势,且各地区均有不同程度的感染。PEDV S1基因序列分析结果表明:分离到的16株PEDV毒株间的S1基因的核苷酸序列同源性为91%~99.8%,氨基酸序列同源性为87.8%~99.7%;山东分离毒株与15个国内外参考毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为90.5%~100%和88.4%~99.9%。对S基因分子流行病学分析发现,7个国外参考毒株、8个国内参考毒株与本次分离到的16个PEDV毒株被分为2个不同的进化分支G1和G2。在2013-2015年分离到的16株毒株中,有3株位于G1中,且距离CV777经典毒株较近;剩余的13株位于G2中,G2则以近年流行毒株为主,而山东分离株主要在G2分支中,这也解释了现有CV777疫苗毒株在山东地区的免疫保护力不佳的原因。本研究结果不仅从分子流行病学角度分析了山东地区PEDV的流行和变异情况,为指导该地区PEDV疫病防制提供了新的参考,并且制备了能够区分PEDV经典毒株和流行毒株的S蛋白单克隆抗体,为本病的实验室鉴别诊断提供了有效的检测工具和重要的理论基础。 相似文献
16.
牛病毒性腹泻病毒BVDV-JL株的分离与鉴定 总被引：3，自引：0，他引：3
本研究从吉林某牛场表现严重腹泻症状濒死牛的胸腺病料样品中分离一株病毒,该病毒在MDBK细胞中盲传4代无细胞病变产生,而通过RT-PCR和间接免疫荧光试验、微量血清中和试验检测表明该分离病毒株为牛病毒性腹泻病毒(BVDV),并命名为BVDV-JL.将BVDV-JL株F4代细胞培养液(10<'7.13>TCID<,50>/... 相似文献
17.
猪繁殖与呼吸综合征病毒安徽株的分离与鉴定 总被引：2，自引：2，他引：0
从安徽地区的发病猪场的病料中,分离到3株致Marc-145细胞病变的病毒（命名为AH1、AH2、AH3）,负染电镜观察结果可见直径约50 nm的有囊膜的球形病毒粒子,细胞超薄切片可见病毒粒子分散在细胞浆内,直径为40～80 nm。理化特性研究结果表明,3株分离毒均对氯仿、乙醚、甲醛、温度(56 ℃)敏感;间接免疫荧光试验结果显示,分离株与美洲型PRRS阳性血清反应,发出强特异性荧光;对分离毒株Nsp2基因序列分析发现：安徽分离毒株Nsp2基因存在两处共90个碱基缺失现象,与JXA1 PRRSV变异株亲缘性最近。初步鉴定该分离株为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒。 相似文献
18.
《中国兽医学报》2016,(9):1501-1506
对1例感染超强马立克氏病病毒的病例进行确诊,对感染病毒的Meq基因进行比较分析。采用病理解剖、PCR检测、病毒分离、动物试验和Meq基因序列分析,对感染病毒进行研究。病理解剖结果为病死鸡的肝脏、脾脏、腺胃、肌胃、十二指肠表现为肿瘤病变。PCR检测结果为病死鸡的组织病料感染马立克氏病病毒。病毒分离和动物试验结果证明该感染病毒是1株马立克氏病超强毒株,该病毒可以引起免疫过CVI988疫苗的鸡发病。Meq基因序列分析表明该病毒与7株马立克氏病病毒参考毒株的同源性为98.8%~99.6%,该病毒在Meq的第115、119和176位氨基酸突变同国内流行株,该检测病毒在Meq的第217位氨基酸突变同超超强马立克氏病毒株。结果表明,通过病理解剖、PCR检测、基因序列分析、病毒分离和动物试验,确诊病鸡感染超强马立克氏病病毒。 相似文献
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PEDV分离株S1基因的重组杆状病毒真核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
为了研究猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)分离株(PEDV/LA/2014/02)纤突蛋白(S1)的真核表达及其反应原性,本研究利用杆状病毒真核表达系统表达出重组His-PEDV-S1蛋白。利用在线软件分析PEDV S1基因在sf9细胞内的稀有密码子,经优化密码子后的基因进行人工合成,合成后的PEDV S1基因被克隆至杆状病毒的穿梭载体(pFastBac HT A)中,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞进行重组,PCR方法验证后将重组成功的杆状病毒基因组转染sf9细胞,获得包装成功的杆状病毒,该病毒进一步接种sf9细胞,显微镜观察重组病毒引起的细胞病变,RT-PCR方法验证PEDV S1基因的mRNA表达水平,SDS-PAGE、Western blotting方法验证重组PEDV S1蛋白的表达及其反应原性。结果显示,试验成功构建了重组穿梭质粒pFastBac HT A-PEDV-S1(pSL598),成功包装表达了PEDV S1的重组杆状病毒,重组杆状病毒能使sf9细胞出现细胞变大、胞内有空泡等典型病变,PEDV S1基因的mRNA获得表达,重组蛋白His-PEDV-S1在sf9细胞中得到表达,蛋白质大小为83 ku左右,主要存在于细胞沉淀中,表达的重组蛋白能与小鼠抗His抗体和猪抗PEDV阳性血清反应,说明该蛋白具有较好的反应原性。本研究为研制PEDV新流行毒株新型亚单位疫苗和防控该毒株的流行提供了材料。 相似文献
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为了研究猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)分离株(PEDV/LA/2014/02)纤突蛋白(S1)的真核表达及其反应原性,本研究利用杆状病毒真核表达系统表达出重组His-PEDV-S1蛋白。利用在线软件分析PEDV S1基因在sf9细胞内的稀有密码子,经优化密码子后的基因进行人工合成,合成后的PEDV S1基因被克隆至杆状病毒的穿梭载体(pFastBac HT A)中,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞进行重组,PCR方法验证后将重组成功的杆状病毒基因组转染sf9细胞,获得包装成功的杆状病毒,该病毒进一步接种sf9细胞,显微镜观察重组病毒引起的细胞病变,RT-PCR方法验证PEDV S1基因的mRNA表达水平,SDS-PAGE、Western blotting方法验证重组PEDV S1蛋白的表达及其反应原性。结果显示,试验成功构建了重组穿梭质粒pFastBac HT A-PEDV-S1(pSL598),成功包装表达了PEDV S1的重组杆状病毒,重组杆状病毒能使sf9细胞出现细胞变大、胞内有空泡等典型病变,PEDV S1基因的mRNA获得表达,重组蛋白His-PEDV-S1在sf9细胞中得到表达,蛋白质大小为83 ku左右,主要存在于细胞沉淀中,表达的重组蛋白能与小鼠抗His抗体和猪抗PEDV阳性血清反应,说明该蛋白具有较好的反应原性。本研究为研制PEDV新流行毒株新型亚单位疫苗和防控该毒株的流行提供了材料。 相似文献