共查询到20条相似文献，搜索用时 78 毫秒
2.
为了获得具有良好免疫原性的猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株M和N双基因融合蛋白,本研究采用RT-PCR方法分别扩增PEDV变异毒株M、N基因,利用限制性内切酶依次将其定向克隆至pMD18-T载体,将串联的N和M融合基因片段亚克隆至pGEX-KG原核表达载体,构建pGEX-NM双基因重组质粒,转化BL21表达菌,经IPTG诱导获得了以包涵体表达的N-M双基因融合蛋白,融合蛋白经Western blot检测能够被兔抗PEDV阳性血清识别,将融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,经间接ELISA检测其抗体效价高达1∶12 800以上。本研究获得了具有良好免疫原性的N-M双基因融合蛋白,为M和N蛋白抗原表位鉴定以及结构与功能研究、PEDV变异机制与免疫机制研究、PED新型疫苗和诊断试剂研究奠定了基础。 相似文献
3.
本研究旨在建立猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV） CH-HuN1301株N蛋白稳定表达细胞系。采用RT-PCR扩增PEDV新流行毒株CH-HuN1301株N基因,分别克隆至原核表达载体pET28a和真核表达载体pEGFP-C1构建重组表达载体,所测定的序列采用Mega 5.0软件进行进化分析。将原核表达的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,重组真核表达载体pEGFP-PEDV-N转染HEK293细胞,经用G418筛选获得稳定的表达细胞系。荧光倒置显微镜观察细胞荧光,免疫过氧化物酶单层细胞染色法（IPMA）检测N蛋白的表达。结果表明,PEDV HuN1301-14毒株N基因大小为1 323 bp,原核表达重组N蛋白分子质量约60 ku,其多克隆抗体与PEDV呈特异性反应,荧光倒置显微镜观察和IPMA检测结果显示N蛋白在HEK293细胞中稳定表达。该细胞系的建立为进一步研究PEDV的诊断方法提供了基础材料。 相似文献
4.
为了获得具有良好活性的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)流行毒株重组蛋白,试验采用PCR扩增、克隆、诱导表达、Western-blot检测、间接ELISA等方法对PEDV流行毒株S1蛋白的主要抗原区域进行了原核表达、鉴定与初步应用研究。结果表明:经PCR扩增得到大小为1 095 bp的S1蛋白主要抗原区域基因;将目的片段定向克隆至pET-30a原核表达载体中,经IPTG诱导获得大小为48. 0 ku的重组蛋白; Western-blot检测显示,重组蛋白可与PEDV阳性血清发生特异性反应;用以重组蛋白为包被抗原初步建立的PEDV抗体间接ELISA方法检测PEDV感染猪场,其阳性感染率达98. 52%,无PEDV免疫史和感染史猪场的阳性感染率为0。说明试验获得了具有良好生物学活性的PEDV流行毒株重组蛋白。 相似文献
5.
6.
猪流行性腹泻病(Porcine epidemic diarrhea,PED)是我国猪群近两年的多发疾病。本试验于2012年在安徽分离到一株猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)AH2012。为研究该变异株N基因的特性,采用RT-PCR方法获得了其N基因片段,经测序后与其他代表性的PEDV基因序列进行同源性比较和遗传进化分析,发现该毒株与近年来在我国流行的几株PEDV变异株同源性在99.399.5%之间,进化分析显示该毒株属于目前流行的PEDV变异株。将其克隆到表达载体pET28a(+)中,构建了重组质粒pET28a-N,经测序鉴定正确后,转化至感受态细胞BL21(DE3)中,并进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌可表达分子量为65 ku的融合蛋白,蛋白表达量较高,蛋白免疫印迹结果显示,表达的N蛋白能与PEDV阳性血清发生特异性的免疫反应,表明原核表达的N蛋白具有良好的反应原性。该研究可为猪流行性腹泻病的流行病学调查、诊断与防控方法的建立奠定基础。 相似文献
7.
《中国动物传染病学报》2016,(3)
采用PCR方法扩增犬瘟热病毒N基因,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建犬瘟热N基因原核表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达重组N蛋白。从包涵体中纯化重组蛋白,制备多克隆抗体,采用Western blot检测其特异性。结果显示PCR扩增得到犬瘟热N基因,重组N蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到表达,制备的多克隆抗体能与N蛋白特异性反应。 相似文献
8.
根据伪狂犬病病毒 Rise毒株 g E基因序列 ,设计合成 1对引物 ,采用 PCR方法 ,从伪狂犬病病毒闽 A株 DNA扩增出 5 5 8bp片段。将该片段克隆到 p UC19质粒中 ,测序正确后再将其克隆到表达质粒 p ET- 2 8a中 ,以 BL 2 1(DE3)为宿主菌 ,在 IPTG诱导下获得了高效表达。经 SDS- PAGE及 Western- blotting鉴定分析 ,表达蛋白大小约 2 30 0 0 ,蛋白薄层扫描分析表明 ,该蛋白约占菌体总蛋白的 30 %。 相似文献
9.
PEDV流行株N基因主要抗原表位原核表达及ELISA方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白抗体的ELISA方法,应用RT-PCR从腹泻仔猪样本中扩增获得了1段PEDV河南流行毒株N基因全长序列,根据对其氨基酸序列的抗原性分析结果,将N基因上2个大的抗原表位区(112321位氨基酸)克隆至原核表达载体pET-32α,构建pET-32α-N重组质粒并转化至宿主菌BL21(DE3)中。将重组菌在37℃条件下加入IPTG进行诱导使该蛋白获得了高效表达,表达产物为融合蛋白,相对分子质量约41 300。Western-blot分析表明,所表达的蛋白可与抗PEDV全病毒小鼠阳性血清发生反应。以纯化的重组N蛋白作为包被抗原建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法,抗原最佳包被量0.226μg/孔,血清最佳稀释度为1∶100,二抗最佳稀释度为1∶2 000,待检血清D450值≥0.28判定为阳性。国内首次用该方法对临床猪血清样本进行了检测,母猪血清PEDV抗体阳性率为84.26%(166/197),仔猪血清阳性率为27.93%(31/111)。结果表明,建立的间接ELISA方法特异性、灵敏性和可重复性良好,可用于临床上PEDV抗体水平的监测和PED流行病学调查。 相似文献
10.
为鉴定猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N)与Vero E6细胞核仁fibrillarin蛋白的亚细胞定位的特征.本实验参照GenBank中人细胞fibrillarin基因(M59849.1)序列,设计并合成特异性引物,利用RT-PCR方法扩增了Vero E6细胞的fibrillarin基因,并将其克隆于真核表达载体pDsRed2-N1中,构建重组质粒pDsRed-Fib.将pDsRed-Fib与本实验室构建的含有PEDV N基因的重组质粒pAcGFP-N,共转染Vero E6细胞.Western blot结果表明fibrillarin及N融合蛋白在转染的Vero E6细胞中均获得表达;利用共聚焦显微镜观察显示在共转染Vero E6细胞中PEDV N蛋白与Vero E6细胞核仁中的fibrillarin发生共定位.该结果为进一步研究PEDV和核仁蛋白相互作用奠定基础. 相似文献
11.
PEDV分离株S1基因的重组杆状病毒真核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
为了研究猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)分离株(PEDV/LA/2014/02)纤突蛋白(S1)的真核表达及其反应原性,本研究利用杆状病毒真核表达系统表达出重组His-PEDV-S1蛋白。利用在线软件分析PEDV S1基因在sf9细胞内的稀有密码子,经优化密码子后的基因进行人工合成,合成后的PEDV S1基因被克隆至杆状病毒的穿梭载体(pFastBac HT A)中,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞进行重组,PCR方法验证后将重组成功的杆状病毒基因组转染sf9细胞,获得包装成功的杆状病毒,该病毒进一步接种sf9细胞,显微镜观察重组病毒引起的细胞病变,RT-PCR方法验证PEDV S1基因的mRNA表达水平,SDS-PAGE、Western blotting方法验证重组PEDV S1蛋白的表达及其反应原性。结果显示,试验成功构建了重组穿梭质粒pFastBac HT A-PEDV-S1(pSL598),成功包装表达了PEDV S1的重组杆状病毒,重组杆状病毒能使sf9细胞出现细胞变大、胞内有空泡等典型病变,PEDV S1基因的mRNA获得表达,重组蛋白His-PEDV-S1在sf9细胞中得到表达,蛋白质大小为83 ku左右,主要存在于细胞沉淀中,表达的重组蛋白能与小鼠抗His抗体和猪抗PEDV阳性血清反应,说明该蛋白具有较好的反应原性。本研究为研制PEDV新流行毒株新型亚单位疫苗和防控该毒株的流行提供了材料。 相似文献
12.
为了了解贵州省猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)的流行情况,试验对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)贵州流行株(GZ2022)N基因序列进行克隆、测序,并利用DNAStar、ProtParam、ProtScale等生物信息学分析软件对PEDV-GZ2022株N基因的同源性和遗传进化地位,以及N蛋白的分子特征和潜在功能进行分析预测。结果表明：PEDV-GZ2022株N基因大小约为1 364 bp,编码441个氨基酸;PEDV-GZ2022株N基因核苷酸序列与GenBank中的PEDV参考毒株N基因的相似性为95.5%～99.8%,与PEDV经典毒株CV777 N基因核苷酸序列的相似性为95.6%,与SDLY2020毒株N基因核苷酸序列的相似性高达99.8%,PEDV-GZ2022毒株与经典毒株CV777关系相隔较远,与PEDV变异株GⅡ-b位于同一分支;PEDV-GZ2022株N蛋白中含有较多的疏水性氨基酸,为疏水性蛋白;该蛋白质存在4个N糖基化位点和37个O糖基化位点,有31个丝氨酸、... 相似文献
13.
为了研究猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)分离株(PEDV/LA/2014/02)纤突蛋白(S1)的真核表达及其反应原性,本研究利用杆状病毒真核表达系统表达出重组His-PEDV-S1蛋白。利用在线软件分析PEDV S1基因在sf9细胞内的稀有密码子,经优化密码子后的基因进行人工合成,合成后的PEDV S1基因被克隆至杆状病毒的穿梭载体(pFastBac HT A)中,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞进行重组,PCR方法验证后将重组成功的杆状病毒基因组转染sf9细胞,获得包装成功的杆状病毒,该病毒进一步接种sf9细胞,显微镜观察重组病毒引起的细胞病变,RT-PCR方法验证PEDV S1基因的mRNA表达水平,SDS-PAGE、Western blotting方法验证重组PEDV S1蛋白的表达及其反应原性。结果显示,试验成功构建了重组穿梭质粒pFastBac HT A-PEDV-S1(pSL598),成功包装表达了PEDV S1的重组杆状病毒,重组杆状病毒能使sf9细胞出现细胞变大、胞内有空泡等典型病变,PEDV S1基因的mRNA获得表达,重组蛋白His-PEDV-S1在sf9细胞中得到表达,蛋白质大小为83 ku左右,主要存在于细胞沉淀中,表达的重组蛋白能与小鼠抗His抗体和猪抗PEDV阳性血清反应,说明该蛋白具有较好的反应原性。本研究为研制PEDV新流行毒株新型亚单位疫苗和防控该毒株的流行提供了材料。 相似文献
14.
《黑龙江畜牧兽医》2017,(17)
为了研究鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)VP1蛋白的优势抗原区,试验根据DHAV-3 VP1基因序列设计4对特异性表达引物,用PCR获得VP1-a~d基因片段,并在p ET-30a(+)/Rosetta(DE3)p LysS系统中进行原核表达;经IPTG诱导重组蛋白获得表达,用Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白;同时以DHAV-3病毒为免疫原制备鼠抗DHAV-3多克隆抗体,通过I-ELISA和Westernblot初步鉴定。结果表明:p ET-30a-VP1-a、p ET-30a-VP1-b、p ET-30a-VP1-c和p ET-30a-VP1-d与鼠抗DHAV-3多克隆抗体都发生反应,抗原量相同的情况下VP1-c和VP1-d段显色较VP1-a和VP1-b深,说明这两段反应性相对较强;4种截短蛋白与鸭抗DHAV-3阳性血清进行反应,只有p ET-30a-VP1-c显色。说明VP1-c免疫原性较强,DHAV-3 VP1蛋白的90~175 aa为其优势抗原区。 相似文献
15.
《畜牧与兽医》2015,(6):1-6
临床分离获得1株猪流行性腹泻病毒(PEDV),对其纤突(S)基因5'端序列分析比较表明,该分离株(NB2011)与目前国内流行的猪流行性腹泻病毒毒株同源性为99%以上,与经典毒株(CV777)的同源性仅为82.6%。经氨基酸分析比较,PEDV纤突蛋白发生明显变异,在抗原位点35-55aa以及100-145aa区间存在很大差异。本试验对CV777株与临床分离的NB2011株的S基因N端差异较大的区段(CV777-S661,NB-S673)进行原核表达,分别获得经典株和流行株S基因N端表达蛋白。Western blotting结果表明,S661和S673重组蛋白均能与PEDV阳性血清产生特异性反应,且不与PEDV阴性血清反应。对两种蛋白进行交叉斑点试验,结果表明两者在反应原性上存在差异。研究结果为进一步阐明PEDV流行毒株抗原表位的变异及研究PEDV免疫保护机制打下基础。 相似文献
16.
《中国预防兽医学报》2021,(5)
猪流行性腹泻病毒(PEDV)编码的Nsp12蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性,在PEDV复制过程中发挥重要作用。为了研究与Nsp12蛋白相互作用的宿主细胞蛋白对PEDV复制的影响,本研究利用酵母双杂交技术将诱饵质粒pGBKT7-Nsp12与猪小肠绒毛上皮细胞(IECs)cDNA酵母表达文库进行杂交筛选,获得的阳性克隆经过测序鉴定证实为环指蛋白7(RNF7),将pGBKT7-Nsp12与p GADT7-RNF7进行酵母回复验证,结果显示二者共转化后能分解SD/-4/X/A中的X-α-Gal形成蓝色菌落,表明Nsp12与RNF7蛋白在酵母中存在相互作用。同时,构建p CAGGS-Nsp12-HA和p CAGGS-Flag-RNF7真核表达载体,利用针对不同标签的抗体进行正向和反向免疫共沉淀鉴定,进一步证实PEDV Nsp12蛋白与RNF7蛋白之间存在直接相互作用;激光共聚焦显微镜观察发现Nsp12蛋白和RNF7蛋白在细胞质中存在共定位现象。为了分析宿主细胞中RNF7蛋白异常表达对PEDV增殖的影响,将构建的RNF7真核表达质粒pcDNA3.1-RNF7转染LLC-PK1细胞后,再用PEDV感染过表达RNF7的LLC-PK1细胞,通过western blot检测LLC-PK1细胞中PEDV N蛋白表达量,荧光定量PCR检测PEDV N基因转录水平,采用TCID50方法检测病毒滴度,结果显示,过表达RNF7后LLCPK1细胞内PEDV N蛋白表达量和N基因拷贝数均下降,其子代病毒滴度也明显低于正常对照组,表明过表达RNF7蛋白可以抑制PEDV的增殖。而利用si RNA-178敲低宿主细胞内源性RNF7蛋白的表达,再以MOI 0.01的PEDV感染后,对感染后不同时间的细胞样品进行western blot检测和病毒滴度检测,结果显示在PEDV感染后24 h,细胞内PEDV N蛋白表达量明显增加,PEDV的滴度在感染后18 h和24 h时分别是对照组的1.10倍和1.17倍。本研究结果首次证实了宿主细胞中RNF7蛋白表达对PEDV的复制发挥负调控作用,为深入探究PEDV复制调控的分子机制奠定了基础。 相似文献
17.
为深入了解仔猪腹泻的病因,本研究在不同发病猪场采集了115份临床样品,通过RT-PCR方法对猪流行性腹泻病毒(PEDV)进行检测,结果显示总阳性率为81.7%。进一步从部分样品中对PEDV的N基因进行克隆和序列分析,结果显示采集的临床样品中各分离株之间的氨基酸同源性高达99%以上,与代表性病毒株CV777的氨基酸同源性为97.4%～98.1%,表明目前流行的PEDV其N基因仍然相对保守的。同时,构建了重组表达载体pGEX-N,经诱导表达显示该重组蛋白呈可溶性表达,重组蛋白大小约为81 ku,western blot分析结果表明该重组蛋白能够被PEDV阳性猪血清特异性识别。将纯化后的重组N蛋白作为包被抗原,对20份已知背景的临床猪血清抗体进行ELISA检测,结果显示有9份血清为抗体阳性,11份血清呈抗体阴性,与应用RT-PCR方法鉴定抗原的结果符合率为85%。本研究表达的重组N蛋白具有良好的抗原性,可以将其作为PEDV血清学诊断的候选抗原。 相似文献
18.
为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)部分N蛋白的原核表达产物是否具有抗原性,并为建立PEDV的间接ELISA方法奠定基础,本试验应用RT-PCR技术扩增N基因的部分核酸序列,经克隆后将目的片段连接到原核表达载体pET-30a(+)中。重组菌于37 ℃、0.5 mmol/L IPTG诱导4 h后进行SDS-PAGE分析,并进行Western blotting鉴定。结果显示,构建的原核表达重组质粒测序正确,且该蛋白与抗血清(PEDV高免血清)具有良好的反应活性。本试验成功构建了PEDV部分N基因原核表达载体,为后续PEDV感染的血清学诊断方法的建立提供依据。 相似文献
19.
20.
旨在构建变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M和N双基因融合质粒,并分析表达蛋白免疫原性。通过扩增变异PEDV FJFQ2014毒株(GenBank登陆号KJ646580)的M基因和N基因,将M基因克隆至pEASY-Blunt E2(pE2)表达载体,构建出pE2-M质粒。利用同源重组原理,采用无缝拼接试剂盒将N基因克隆至E2-M片段,转化到Trans 1-T1感受态细胞中,构建出pE2-M-N融合双基因质粒并转化Transetta(DE3),表达出相应的融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot验证蛋白的表达情况。将纯化的M-N融合蛋白皮下接种BLAB/c小鼠,通过ELISA方法检测融合蛋白的免疫原性。结果表明:扩增出M和N基因,成功构建了pE2-M质粒,并将E2-M基因与N基因进行有效连接,构建出pE2-M-N融合双基因质粒,表达出了具有免疫原性的M-N融合蛋白,该蛋白能够诱导小鼠产生相应的特异性抗体。变异PEDV的pE2-M-N双基因融合质粒的构建,为进一步开展变异PEDV的诊断技术和免疫学等研究,奠定良好基础。 相似文献