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1.
TaqMan(R) RT-PCR对水疱性口炎病毒的鉴定检测 总被引：3，自引：3，他引：0
水疱性口炎分为印第安那型(Indiana)和新泽西型(New Jersey)。这两种血清型病毒的快速和可靠的鉴别对该病的诊断、检疫、分子流行病学调查和监测至关重要。文章按照VSV核蛋白基因序列,设计了一对两型通用引物和两型各自特异性探针。研究建立了VSV实时荧光定量PCR检测方法,对VSV细胞培养物、人工感染实验动物组织、血清样品,以及系列稀释的不同TCID50样品、其它相关或相似病毒进行鉴定,同时与常规PCR、病毒分离试验作了比较。TaqMan RT-PCR的特异性和敏感性相当于或优于对照方法。重复性和稳定性试验证实,该方法可靠。每个试验中设立阳性、阴性对照和标准稀释度对照,使试验结果可对病毒RNA作准确定量,并可在4h内获得结果。研究结果表明,TaqMan RT-PCR方法是一种特异性强、敏感性高、快速安全的定量检测方法。因此,可以作为VSV的快速检测和定型。 相似文献
2.
《中国兽医杂志》2015,(5)
本研究建立荧光定量RT-PCR鉴别检测水疱性口炎病毒的方法。针对Gen Bank登录的水疱性口炎两血清型-新泽西型(VSV-NJ)和印第安纳型(VSV-IND)的L基因保守区,设计1对引物和2条探针。通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了Taq Man荧光定量RT-PCR快速检测VSV的方法。与常规RT-PCR试验比较表明,所建立的荧光RT-PCR检测技术快速、敏感,检测时限3 h以内,具有很好的特异性和重复性,可以实现水疱性口炎病毒的快速检测分型。通过对342份临床样品进行检测,结果表明,所建立的检测方法适用于样品中水疱性口炎病毒的直接检测。 相似文献
3.
根据GenBank中CPV VP2蛋白基因序列,选择CPV VP2基因保守序列,分别设计1对特异性引物和TaqMan探针,建立了CPV Taq Man荧光定量PCR检测方法。对CPV Taq Man荧光定量PCR的反应体系和反应条件进行优化,并对其特异性和敏感性进行了测定,建立标准曲线。结果,CPV Taq Man荧光定量PCR对CPV检测阳性,并能对10拷贝/μL的CPV模板检测阳性,标准曲线的相关系数为0.9992,但对非CPV模板检测阴性。结果表明,所建立的CPV Taq Man荧光定量PCR具有很好的特异性和敏感性,标准曲线具有很强的实用性。同时对CPV Taq Man荧光定量PCR与CPV PCR进行了比较试验,结果前者比后者的敏感性高100倍。采用CPVHA、CPV PCR与CPV Taq Man荧光定量PCR对55份临床样品进行检测,CPV HA对30份样品检测阳性,CPVPCR对40份样品检测阳性,CPV Taq Man荧光定量PCR对47份样品检测阳性。这表明,CPV Taq Man荧光定量PCR对样品的检出率最高,具有特异、敏感、快速的特点,适用临床样品的检测。 相似文献
4.
《中国家禽》2017,(20)
研究旨在建立一种适用于鸭坦布苏病毒检测的荧光定量Taq Man RT-PCR技术。以JXSP株RNA为模板,建立检测鸭坦布苏病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。制备含有上述目的片段的RNA作为标准品,10倍比稀释后建立标准曲线,测定敏感性。同时采用标准品对该方法的批内和批间重复性进行检测,并与本实验室所保存的多种病毒进行特异性检测。结果:建立的荧光定量Taq Man RT-PCR方法能在鸭坦布苏病毒JXSP株RNA样本中检出荧光信号。最低检出量为2.06×10~1拷贝/反应;线性范围达9个数量级。该方法重复性良好,批内变异系数不足0.4%;批间变异系数不足2.2%。该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,经体外感染细胞培养物及临床样品检测证实,该方法可实时反映病毒液中的病毒含量,可在获得样品后3 h以内得到检测结果,可用于临床样品中鸭坦布苏病毒的快速检测。 相似文献
5.
为了建立一种快速、特异、灵敏的检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Taq Man实时荧光定量RT-PCR的方法,根据NCBI GenBank上已公布的BVDV、猪瘟病毒(CSFV)核酸序列进行比对,利用Oligo 6.71软件设计一对引物及一条探针,建立了检测BVDV的Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法。通过对该方法的特异性、重复性及其敏感性进行相关试验,结果表明该方法检测出BVDV标准毒株Oregon C_(24)V为阳性,猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和CSFV的检测均为阴性。对BVDV标准毒株最低检测量达到10~(-2.5) TCID_(50)。该方法检测同一样品重复进行8次检测,结果均一致,表明方法的重复性较好。应用该方法对6批猪瘟疫苗专用血清进行BVDV检测,阳性率为16.7%;猪瘟弱毒苗中未检出BVDV。建立的BVDV Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法为生产无BVDV污染的猪瘟苗提供了有力的保障。 相似文献
6.
水泡性口炎病毒血清型特异LUX实时荧光RT-PCR检测方法的建立 总被引：5，自引：0，他引：5
采用LUX荧光核酸扩增技术原理,以水泡性口炎病毒（VSV）NJ、IND型NS基因为模板分别设计并合成单标记LUX荧光引物,建立血清型特异的VSV荧光RT—PCR检测方法。试验表明,两种型特异的LUX荧光RT-PCR能分别特异地鉴定VSV血清型,对口蹄疫、猪水泡病等病毒以及对照细胞、健康动物组织RNA样品的检测结果均为阴性。对比检测试验表明,LUX荧光RT—PCR的检测敏感性比常规RT-PCR提高达10倍以上,对VSV细胞增殖病毒液的检测灵敏度可达1 TCID50。对人工感染豚鼠样品以及临床样品的检测试验证实,该LUX荧光RT—PCR可有效检测到人工感染动物组织以及进口牛临床样品中的水泡性口炎病毒,并能鉴定感染病毒血清型。所报道的检测方法,包括样品核酸提取、LUX荧光RT—PCR以及熔解曲线分析,可在3h内完成。 相似文献
7.
为了快速检测无临床症状的山羊是否感染山羊伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis),根据Gen Bank中伪结核棒状杆菌磷脂酶D(phospholipase D,PLD)基因序列,分别设计1对特异性引物和Taq Man探针,经过反应条件和体系优化,测定特异性、敏感性和稳定性,建立山羊伪结核病Taq Man荧光定量PCR检测方法,并对54份临床样品进行检测。结果显示:建立的山羊伪结核棒状杆菌方法具有很好的特异性,在20μL扩增体系中,引物浓度为0.20μmol/m L,探针浓度为0.45μmol/m L,退火温度59℃时最佳;最低可检测出4.6×102个拷贝数的细菌DNA,标准曲线相关系数是0.996。同时,对Taq Man荧光定量PCR和常规PCR进行了比较,前者的敏感性是后者的1 000倍;对54份临床样品进行检测,Taq Man荧光定量PCR检出的阳性率为68.5%(37/54),常规PCR检出的阳性率为53.7%(29/54)。研究表明:Taq Man荧光定量PCR法检出率较高,有特异、敏感且快速的特点,适用于临床样品的检测。 相似文献
8.
《黑龙江畜牧兽医》2015,(11)
为了快速准确检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)并对病毒拷贝数进行定量,试验根据Gen Bank中PCV-2保守序列(登录号为FJ644559.1)设计1对特异性引物和Taq Man探针,制备标准品,建立PCV-2的荧光定量检测方法,并对临床样品进行检测。结果表明:该方法在1×101~1×108拷贝/μL的模板范围内具有良好的线性关系,相关系数可达0.999;敏感性是常规PCR方法的100倍;对猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)均为阴性,没有交叉反应;批内、批间重复试验变异系数均小于2.50%;在临床检测中,比常规PCR方法检测PCV-2的阳性检出率高出38%。说明试验成功建立了PCV-2 Taq Man荧光定量PCR检测方法,可用于临床检测PCV-2感染及对其拷贝数进行定量。 相似文献
9.
为建立猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒一步法荧光RT-PCR鉴别检测方法。本研究参照Gen Bank中猪流行性腹泻病毒以及传染性胃肠炎病毒特异性基因序列,设计特异引物和Taq Man探针,通过优化反应条件,建立了检测猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒的一步法荧光RT-PCR方法,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果表明,该方法检测猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒灵敏度分别可达0.32 TCID_(50)/100μL和1.58 TCID_(50)/100μL,该法对猪轮状病毒(RV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性。本试验建立的Taq Man一步法荧光定量RT-PCR检测方法可对猪流行性腹泻和传染性胃肠炎进行快速诊断,适合现场检测,为猪病毒性腹泻的诊断和防控奠定了基础。 相似文献
10.
《中国兽医杂志》2017,(5)
为建立牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)荧光定量PCR检测方法,本研究利用IBRV g B基因序列设计引物及相应探针,分别建立Taq Man探针与SYBR Green 1荧光定量PCR方法,并对两种方法的敏感性等综合比较。结果显示,SYBR Green 1荧光定量PCR方法的相关系数(R2)为0.998,扩增效率(E)为95.7%;Taq Man探针荧光定量PCR方法的R2为0.999,E为108.3%;两种方法的敏感性均为0.2 TCID50,变异系数均小于3%。综合结果显示,两种检测方法无显著差异。最后,本研究成功建立了检测IBRV的荧光定量PCR,将为IBRV的临床检测提供方法。 相似文献
11.
《中国动物检疫》2019,(11)
为鉴别检测犬腺病毒(CAV)Ⅰ型和Ⅱ型,根据GenBank中CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ型参考基因序列,设计合成1对通用引物和2条鉴别探针,建立了可鉴别检测CAV-Ⅰ型和CAV-Ⅱ型的双重荧光定量PCR检测方法。同时,对该方法进行了优化,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了试验,并与普通PCR检测方法进行样品检测符合率分析。特异性试验结果显示;本研究建立方法对犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬冠状病毒均未产生扩增曲线。敏感性试验结果显示,建立方法对CAV-Ⅰ的检测敏感度为100 copies/μL,对CAV-Ⅱ的检测敏感度为10 copies/μL。重复性试验结果显示,组内和组间变异系数均小于5%。临床样品检测对比结果显示,建立方法与普通PCR方法的符合率为95.12%。结果表明,本研究建立的Taq Man双重荧光定量PCR方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好等优点,可用于临床鉴别检测CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ型。本研究为CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ型感染的检测、鉴别以及流行病学调查提供了便捷快速的方法。 相似文献
12.
本研究针对A型猪塞内卡病毒(Senecavirus A, SVA)基因组保守区域设计了特异性引物及探针,建立了快速检测SVA的Taq Man荧光定量PCR方法。结果显示,以构建的重组质粒为标准品建立的Taq Man荧光定量PCR方法,标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数达0.9974;特异性良好,与口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒不存在交叉反应;对SVA核酸最低检测下限为3.75 copies/μL,而普通PCR最低检测下限为3.75×103 copies/μL;批内和批间的变异系数为均小于5%,重复性良好。本研究建立的SVA TaqMan荧光定量PCR方法为检测猪水疱性疾病病原提供了一种快速、灵敏的检测方法,为开展SVA流行病学调查提供了技术支持。 相似文献
13.
《黑龙江畜牧兽医》2016,(3)
为了建立一种快速、敏感和特异地检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的方法,试验根据ASFV CP530R基因序列设计1对特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立了一种检测ASFV的Taq Man-MGB探针实时荧光PCR方法,并对该方法进行了特异性、定量线性范围、敏感性和重复性等试验评价。结果表明:该方法仅对ASFV发生特异性扩增反应,不与伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)、经典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪流感病毒(SIV)发生交叉反应,具有良好的特异性。用该方法检测质粒标准对照(PCR2.1-ASFV-CP530R)的线性范围为6.1×102~6.1×109copies/μL,标准曲线方程为y=-3.449x+38.10,相关系数(R2)为0.999,最低可检测到61个拷贝的质粒标准对照分子;对5个不同浓度(6.1×103~6.1×107copies/μL)的质粒标准对照进行双份样品的4次重复检测,每个浓度质粒标准对照的Ct值变异系数均小于2.0%,具有良好的重现性;用该方法对126份进口猪的血液样品和38份猪肉样品进行ASFV检测,结果均为阴性。说明本方法可用于活猪临床样品和生猪样品中ASFV的检测。 相似文献
14.
4种动物虫媒病病毒多重RT-PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
分别设计和合成4对特异性引物,通过对反应条件的优化,初步建立了鉴别蓝舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血病病毒(EHDV)、水疱性口炎病毒(VSV)和赤羽病病毒(AKV)的多重RT-PCR检测方法,并对其特异性和敏感性进行了检测。结果表明,所设计的4对引物可对同一样品中的VSV、BTV、EHDV和AKV进行特异性扩增,所扩增的目的片段的长度分别为301、351、537、250bp。建立的四重RT-PCR检测方法能够检测出10-7稀释的细胞培养病毒液,4种病毒之间没有发生交叉反应,说明该检测方法特异性强,敏感性较高。所建立的多重RT-PCR方法可用于上述4种动物虫媒病病毒的快速鉴别诊断,在动物检疫、临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。 相似文献
15.
《中国动物传染病学报》2015,(3)
根据伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,RV)g B基因保守序列,设计合成一套特异引物和Taq Man探针,建立了一种快速、敏感和特异的检测伪狂犬病毒的实时荧光定量PCR方法。该方法可检测到相当于10 copies/μL的病毒DNA,比常规PCR检测方法高约100倍,敏感性较强;该方法检验猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型呈现阴性结果,特异性强;变异系数小于1%,具有良好的重复性。本研究建立的实时荧光定量PCR方法为临床上对伪狂犬病毒的检测和定量奠定了坚实基础。 相似文献
16.
利用单克隆抗体技术制备抗口蹄疫病毒的单克隆抗体,特异性试验表明其只与O、A、Asia 1型3种血清型FMDV抗原结合。进而采用胶体金标记技术,以胶体金标记的抗口蹄疫病毒单克隆抗体、多克隆血清抗体和葡萄球菌A蛋白为主要材料,研制口蹄疫快速检测试纸条。该试纸条检测O、A、Asia 1型3种血清型灭活口蹄疫病毒均为阳性,检测水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、蓝舌病病毒、猪蓝耳病病毒4种灭活抗原及小反刍兽疫病毒疫苗株均为阴性,试验结果与口蹄疫实时荧光定量RT-PCR方法的完全一致,表明其具有良好的特异性。敏感性试验结果是,试纸条的检测极限为1∶160稀释的样品,其敏感性相当于实时荧光定量RT-PCR方法的1/64。由于试纸条具有操作方便、检测快速等优点,因此该试纸条可以用于大量临床样品的快速检测和现场检测。 相似文献
17.
鸡传染性法氏囊病病毒实时荧光定量RT—PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
本试验根据GenBank中鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组设计一对针对病毒vp5基因的引物和一条特异性Taq Man探针,建立了一种快速检测IBDV核酸载量的Taq Man荧光定量RT-PCR方法.通过对反应条件和反应体系的优化,使得该方法在108拷贝/μL～101拷贝/μL范围内具有良好的线性关系.能够灵敏地检测初始模板中30个拷贝的病毒核酸,其灵敏度是常规RT-PCR检测方法的100倍.该方法不与其它的禽源病毒发生非特异性反应,并且具有良好的重复性,为IBDV的定性定量检测提供了有效的工具. 相似文献
18.
猪流感病毒M基因实时荧光定量PCR诊断方法的建立 总被引：6，自引：1，他引：5
根据猪流感病毒(SIV)M基因的保守序列,设计并合成一对特异性引物和Taq Man MGB探针,建立了SIV M基因实时荧光定量PCR检测方法.使用含有M基因的重组质粒pMD-M作为标准品绘制标准曲线.其相关系数为0.999,检测结果表明:该方法的敏感性可达到1个EID50,组间与组内重复试验变异系数分别为0.21%和0.65%,除SIV外,其他5种猪病病毒检测均为阴性,样品检测与病毒滴定及病毒分离结果的符合率均达到100%,该方法特异性强、重复性好,有望成为SIV的一种特异、敏感、快速的定量检测方法. 相似文献
19.
《中国预防兽医学报》2015,(11)
为建立灵敏、特异的G9型猪轮状病毒(Po RV)Taq Man的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究根据Gen Bank中登录的G9型Po RV NMTL株的VP7基因保守区域设计一条特异性引物和探针。以104TCID50的病毒液所提取的总RNA进行10倍系列稀释作为标准品,通过对反应条件进行优化,建立了检测G9型Po RV的Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,该方法的相关系数R2=0.991,对其它常见的Po RV(G5)、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒2型等猪病病原检测均为阴性,具有良好的特异性;该方法最低可以检测到的病毒滴度为10-3TCID50,比普通RT-PCR方法灵敏度高约1 000倍;组内和组间变异系数均小于0.87%,稳定性高,重复性好。对疑似感染Po RV的45份临床病料样品进行检测,结果表明,该方法阳性率(64.4%)高于普通RT-PCR(44.4%),两者总符合率为80%。本研究建立的方法为Po RV的流行病学调查和早期诊断奠定基础。 相似文献
20.
《中国预防兽医学报》2015,(12)
为评估Taq Man荧光定量PCR应用于饲料沙门氏菌检测的可行性,本研究以沙门氏菌JEO402-1基因为靶基因,并采用已建立的沙门氏菌Taq Man荧光定量PCR检测方法,进行了特异性、灵敏度、检测限等相关方法学验证。结果显示:Taq Man荧光定量PCR法特异性良好,在饲料加标样本检测中的最低检测限为2×10~(-1)cfu/m L。重复性试验表明,在不同浓度样本中的变异系数均低于1.0%,具有较高的重复性和稳定性。利用该方法和传统培养法对72份饲料样本进行检测,结果显示两种方法检测结果符合率为65.3%,Taq Man荧光定量PCR法阳性检出率比传统培养法高34.7%;传统培养法检测阳性样本,PCR法检测结果均为阳性。以上结果表明,本研究建立的Taq Man荧光定量PCR法可以应用于饲料样本的沙门氏菌检测。 相似文献