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1.
为了构建猪流感病毒A/swine/Tian Jin/6/2013(H1N1)的反向遗传操作技术平台,通过RT-PCR技术分别扩增了欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的8个基因片段,并分别连接至双向转录表达载体p BD上。纯化8个重组质粒,共转染到293T细胞。54 h后收集上清,并接种到MDCK细胞。待细胞病变明显时,进行血凝试验检测收集到的上清,测得血凝效价为1∶32。测定拯救病毒的全基因组序列,结果显示,在核苷酸序列上,拯救病毒与野生病毒完全一致。细胞病变情况显示,拯救毒株与野生毒株无明显差别。本研究成功拯救了欧洲类禽H1 N1亚型猪流感病毒,为猪流感病毒的致病机理、基因功能研究以及H1N1亚型猪流感病毒新型疫苗的研发奠定了基础。 相似文献
2.
利用RT-PCR技术扩增古典H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2011株的8个目的基因片段,分别克隆至双向转录表达载体p BD上。将8个重组质粒纯化后共转染293T细胞,48 h后收集上清,接种MDCK细胞。当细胞出现明显病变时,收集MDCK细胞上清,其血凝效价为1:64,与原始野生株血凝效价一致;提取拯救病毒的RNA并进行8个目的片段扩增及序列分析,测序结果显示与野生株病毒相同,表明病毒拯救成功。古典H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的成功建立,不仅为探索流感病毒致病机理、感染机制及功能研究奠定了基础,同时也为H1N1亚型猪流感病毒新型疫苗的研制开辟了新的途径。 相似文献
3.
《中国动物传染病学报》2017,(3)
利用RT-PCR技术扩增三源重组H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/Tianjin/10/2013(H1N1)的8个基因片段,分别克隆至双向转录/表达载体p BD上。将8个重组质粒纯化后共转染293T细胞,收取转染48 h后的细胞上清并接种MDCK细胞,成功拯救出有血凝活性的病毒。全基因序列测定结果表明,拯救病毒与野生病毒的核苷酸序列完全一致。生长曲线的测定结果表明,不同时间点野生毒株与拯救毒株在MDCK细胞上的病毒滴度没有明显差异。三源重组H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的成功建立为进一步开展猪流感病毒的生物学特性研究奠定了基础,同时也为H1N1亚型猪流感疫苗的研制开辟了新的途径。 相似文献
4.
猪流感病毒H1N1广东分离株HA基因的克隆与进化分析 总被引：1，自引：1，他引：0
采用常规的血清学试验和特异性RT-PCR,从广东不同地区猪场分离鉴定出8株H1N1亚型猪流感病毒(SIV)。用流感病毒血凝素(HA)基因通用引物扩增了8株病毒的血凝素(HA)基因,经克隆测序,HA基因全长1 757 bp,编码566个氨基酸。8个毒株的HA基因推导氨基酸序列分析表明,均含有8个潜在的N糖基化位点,且糖基化位点相同,其HA1、HA2之间切割位点序列为IPSIQSR↓G,从分子水平推论,此8株H1N1 SIV均属于非高致病性毒株。同源性分析表明,此8株病毒的氨基酸序列与经典SIV之间的同源性在92.3%~94.7%之间;与2009年甲型H1N1流感病毒同源性在80.4%~92.4%之间;与欧洲类禽SIV分离株同源性在80.4%~84.1%之间。进化关系表明,该8株SIV与A-swine-Shanghai-3-2005-H1N1同处一分支,与2009年甲型H1N1流感病毒和经典SIV分离株亲缘关系较近,与欧洲类禽SIV分离株亲缘关系较远。 相似文献
5.
《中国兽医学报》2017,(1)
对宁夏地区2011年分离到的5株H1N1亚型猪流感病毒进行了基因组测定和遗传进化分析。结果显示:宁夏地区H1N1亚型猪流感病毒具有多样性,5株分离株可分为3类,其中1株为类人H1N1猪流感病毒,2株为经典猪流感病毒,另外2株为重组猪流感病毒,其PB2、PB1、PA、NP、NS基因来源于北美三元重组猪流感病毒,HA、NA、M基因来源于经典猪流感病毒;HA蛋白裂解位点附近氨基酸分析显示5株H1N1亚型猪流感分离株均为低致病性毒株;序列分析结果显示5株病毒在HA蛋白受体结合位点、抗原位点,以及NA蛋白潜在糖基化位点处氨基酸存在差异,这些差异具有分支特异性。5株病毒在NA和M2蛋白上均未出现与神经氨酸酶抑制剂和金刚烷胺耐药性相关的氨基酸变异,但其中3株病毒的PB2蛋白基因具有哺乳动物适应性变异E627K。 相似文献
6.
利用RT-PCR技术扩增猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07（H1N2）的8个基因片段,分别克隆至双向转录表达载体PBD上,构建出8个能在哺乳细胞中复制和表达的质粒。将8个质粒共转染293T细胞,收取转染48 h时的细胞上清并接种9～11日龄SPF鸡胚,成功拯救出有血凝活性的病毒。经序列测定,确定拯救病毒的8个基因片段均来自猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07（H1N2）基因组。H1N2亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的成功建立为猪流感病毒致病机理、传播机制及病毒基因功能的研究奠定了基础;同时,为H1N2亚型猪流感新型疫苗的研制开辟了新的途径。 相似文献
7.
8.
到目前为止,意大利已经分离到了H1N1、H1N2和H3N2 3个亚型猪流感病毒。2006年,在一例有咳嗽症状的猪上分离到了一种新的猪流感病毒亚型(H3N1)。通过对肺组织的RT-PCR检测,对试验猪人工感染该新亚型流感病毒及利用空斑试验对该毒株的克隆鉴定,证实了这一独特的H和N组合的猪流感病毒的存在。同时,对该新型毒株进行了抗原及遗传特性鉴定。基因系统发育分析结果表明,H3N1亚型的完整HA基因序列与3株意大利H3N2亚型具有高度的一致性。这3个意大利亚型中有一株分离于2001年,其它2株分离于2004年,而该毒株的NA序列全长与2004年于意大利分离得到的3株H1N1亚型猪流感病毒极其相似。其余的基因片段也分别与当前意大利流行的H1N1与H3N2猪流感病毒极为相似。这表明,该新亚型猪流感病毒可能是H1N1与H3N2亚型的一个重组体。 相似文献
9.
《中国动物传染病学报》2017,(2)
利用RT-PCR技术扩增了禽源H9N2亚型猪流感病毒A/Swine/Guangxi/7/2007(H9N2)的8个目的基因片段,分别克隆至pBD双向转录表达载体。将8个重组质粒纯化后共转染293T细胞,54 h后收集上清,接种MDCK细胞。当拯救的病毒在MDCK细胞上增殖至第3代时,收集的细胞上清经检测具有血凝效价。经过测序分析,确定获救病毒的8个基因片段序列与野生株完全一致,表明病毒拯救成功。禽源H9N2亚型猪流感病毒反向遗传操作技术平台的成功建立为探索猪流感病毒致病机理、传播机制与基因功能研究奠定了基础。 相似文献
10.
本研究2012年底从辽宁省某屠宰场猪鼻咽拭子样品中分离到1株流感病毒,经HA—HI试验和RT—PCR鉴定为H1N1亚型猪流感病毒株,命名为A／swine/Liaoning／01／2012（H1N1）,通过对病毒的8个基因片段克隆并测序,并利用分子生物学软件进行遗传演化分析。结果表明,分离株HA基因裂解位点附近的氨基酸序列为IPSIQSRjG,符合低致病力流感病毒的分子特征。全基因组进化树结果表明,分离株的8个基因片段与A／swine／Jiangsu／40／2011（H1N1）株核苷酸同源性最高,分离株处在类禽型H1N1亚型遗传进化分支上;由于类禽型H1N1猪流感病毒具有潜在感染人的潜力,在国外和国内均有感染人的报道,因此,辽宁省首次分离到该型猪流感病毒对全省养猪业和公共卫生安全具有重要意义,值得深入研究。 相似文献
11.
猪流感病毒H1、H3、N1、N2亚型分型 RT-PCR方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中H1N1和H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(neuraminidase,NA)和M基因保守序列,分别设计合成了5对特异性引物,利用RT-PCR技术对SIV的型和亚型进行鉴定。结果表明,该方法的型RT-PCR可以检测出104 EID50病毒量所提取的RNA;H1、H3、N1和N2的亚型RT-PCR均可以检测出104 EID50病毒量所提取的RNA。除每对特异性引物所对应的亚型外,对其他亚型及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的检测均为阴性,应用该方法对临床样品进行检测,其结果与病毒分离结果符合率为100%。结果表明,该方法特异性好、敏感性高,有望成为SIV的一种特异、敏感、快速的分型检测方法,为猪流感分子流行病学的调查奠定了良好的基础。 相似文献
12.
为了解猪流感病毒(SIV)的变异情况,我们2009年11月从河北某养殖场采集呈流感症状的猪鼻拭子40份,接种10日龄SPF鸡胚,分离到一株猪流感病毒,通过RT-PCR和血凝抑制试验鉴定为H1N1亚型,命名为A/swine/Hebei/15/2009(H1N1),其全基因序列测定及同源性分析发现,8个基因片段均与2000年左右H1N1人流感病毒有较高的同源性。系统遗传演化显示,该病毒分离株是由2000年人源H1N1流感病毒A/Dunedin/2/2000(H1N1)进化而来。抗原性分析显示该株与甲型H1N1流感病毒和经典H1N1病毒株抗原性差异较大。对小鼠致病性试验表明该病毒株可以直接感染小鼠并导致小鼠轻微临床症状和组织病理学变化,但不致死小鼠,表现为低致病性。 相似文献
13.
旨在了解河南省猪流感病毒的流行情况及其遗传进化和基因组特征。2018年4月，从河南省某一出现疑似流感症状猪群中采集鼻拭子样品150份用于分离病毒，对分离病毒的全基因组进行序列测定和分析。同时感染6周龄BALB/c小鼠，研究其对小鼠的致病性。结果显示，获得1株H1N1亚型病毒[命名为A/swine/Henan/NY20/2018（H1N1）]。遗传进化表明，其HA和NA基因属于欧亚类禽H1N1分支，PB2、PB1、PA、NP和M基因属于2009甲型H1N1分支，NS基因属于经典H1N1分支。HA蛋白的裂解位点序列为PSIQSR↓GL，具有低致病性流感病毒的分子特征，在小鼠肺和鼻甲有效复制并能引起肺组织病理学变化。本研究分离到1株3源重排H1N1亚型病毒，对小鼠呈现一定致病力，提示应进一步加强对SIV的监测。 相似文献
14.
对2009年H1N1甲型流感流行前后的上海地区养殖场户410份猪血清样品,分别采用血凝抑制试验（hemagglutination inhibition,HI）和酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）进行检测H1N1甲型流感病毒和猪流感病毒（Swine in？uenza virus,SIV）。检测结果表明,除2007年外,2008~2010年猪血清中均存在不同水平的HI抗体,阳性率呈显著上升趋势,且抗体水平与猪群饲养周期及饲养密度正相关,而与猪流感病毒的流行无相关性。 相似文献
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为了解华南地区猪群中猪流感病毒(SIV)的流行及其遗传变异情况,本研究从2016年~2017年广东、广西等地猪群236份猪肺脏病料组织和143份鼻拭子样品中分离鉴定得到3株SIV,全基因组测序和遗传演化分析结果显示,3个分离株均属于H1N1亚型欧亚类禽分支SIV,并且均与pdm09分支病毒株发生了重组。HA蛋白分子特征分析结果显示,A/Swine/Guangxi/NK/2016 HA蛋白第23位糖基化位点发生了缺失。3265份血清样品抗体监测结果显示,欧亚类禽H1N1、pdm09 H1N1和H3N2 SIV的血清抗体阳性率分别为27.53%、20.98%和34.85%。另外,0.64%的(21份)血清样品为H9N2亚型流感病毒抗体阳性,并且猪群中不同亚型和不同分支SIV之间混合感染的情况非常普遍。猪群中流感病毒血清抗体监测结果显示,EA H1N1、pdm09和H3N2亚型SIV HI抗体滴度最高均可达到1:1280,而H9N2亚型HI抗体滴度最高为1:160,表明H9N2 AIV虽然可以感染猪,但对猪还不适应。各月份的血清抗体阳性率分析显示,SIV的流行具有季节性,冬季(11月、12月和1月份)的流行最为严重。本研究可为华南地区猪群SI防控及疫苗株的筛选提供参考依据。 相似文献
17.
为建立一种快速、简便、准确的方法以诊断和检测H1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV),试验根据H1亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计并合成1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,建立检测H1亚型SIV的一步法实时荧光定量RT-PCR技术。结果显示,该方法的敏感性可达102拷贝/μL,除H1亚型SIV外,对H3N2亚型SIV、H9N1亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒的检测均为阴性,且应用该方法对疑似猪流感样品进行检测,其结果与SPF鸡胚分离病毒方法结果的符合率为94%。本试验结果表明该方法特异性强、重复性好,有望成为一种特异、敏感、快速、定量检测H1亚型SIV的方法。 相似文献
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中国类禽型H1N1亚型猪流感病毒的发现和遗传分析 总被引：1，自引：0，他引：1
采用禽流感病毒通用引物,对2006年发现的1株H1N1亚型的类禽型猪流感病毒的全基因组进行了测序,并进行了遗传学分析。序列分析表明它的8个片段与欧洲的类禽型猪流感病毒A/swine/Ile et Vilaine/1455/99(H1N1)病毒和A/swine/Cotes d'Armor/1488/99(H1N1)病毒的相应基因具有高度的同源性,同源性可达97%~99%,表明类禽型猪流感病毒已在中国出现。其血凝素基因的190E→D和225G→E的突变使得其结合NeuAc-a2,6Gal受体的能力高于NeuAca2,3Gal受体。欧洲的类禽型猪流感病毒可以直接感染人,并且可导致人的肺炎和死亡。中国类禽型猪流感病毒的发现及其的NeuAca2,6Gal受体结合特性使其成为一个潜在可感染人的病毒。 相似文献