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1.
为鉴定兔出血症病毒(RHDV)在感染兔肝脏过程中与肝细胞膜表面相互作用的靶蛋白,本研究利用SMART文库构建技术构建了兔肝脏细胞的真核表达cDNA重组质粒文库,将其转染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选表达兔肝细胞蛋白的阳性SP2/0细胞.以RHDV-VP60蛋白作为固相包被抗原,经筛选,获得能够与VP60蛋白相互结合的表达性阳性SP2/0细胞克隆.测序表明26个克隆与兔的一些功能性蛋白有较高的同源性,其中包括代谢酶类13个、免疫信号通路受体蛋白5个以及其他细胞膜蛋白等.本研究鉴定的与RHDV VP60具有结合性的细胞蛋白为RHDV感染机制的研究奠定了基础. 相似文献
2.
《黑龙江畜牧兽医》2014,(23)
为了研究兔出血症病毒(RHDV)蛋白与宿主蛋白的相互作用,试验采用RT-PCR技术从病毒基因组中扩增病毒的7种非结构蛋白P16、P23、2C-like protein、P29、VPg、3C-like protease、RNA复制酶(RdRp)及小结构蛋白VP10、主要结构蛋白VP60,测序正确后,定向克隆至p GBKT7载体,经转化酵母菌AH109验证诱饵载体p GBKT7-X的自激活活性和毒性作用。结果表明:诱饵载体p GBKT7-X对酵母细胞无毒性作用,且对报告基因无自激活现象。说明构建的诱饵载体可以用于酵母双杂交系统筛选与RHDV相互作用的宿主蛋白。 相似文献
3.
为建立稳定表达层黏连蛋白受体(LamR)RK13细胞系(RK13-LamR),并研究LamR蛋白在兔出血症病毒(RHDV)与宿主细胞结合中的作用,将完整的LamR序列通过同源重组克隆入慢病毒表达载体pLVX-m Cherry,并将该重组质粒pLVX-m Cherry-LamR与慢病毒包装质粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG共转染293T细胞,在293T细胞中包装成含目的基因的重组慢病毒。将收获的重组病毒感染RK13细胞,经过嘌呤霉素筛选和细胞有限稀释法,筛选出表达LamR蛋白的RK13细胞。通过间接免疫荧光试验(IFA)和Western blotting证明所获细胞株能够稳定表达LamR蛋白,将细胞株命名为RK13-LamR。以纯化的RHDV接种RK13-LamR细胞,IFA检测结果显示,LamR蛋白能促进RHDV对RK13细胞的吸附。本研究建立了RHDV相对敏感的细胞株,证实在RHDV吸附宿主细胞的过程中,LamR蛋白起到一定的作用。 相似文献
4.
《畜牧兽医学报》2016,(2)
为检测兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)P区形成二聚体的能力及其与HBGAs受体结合的能力,作者以pMD19T-VP60为模板扩增包含铰链区H的P区基因(HP)并克隆至原核表达载体pET28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,获得HP蛋白。经SDS-PAGE和Western blot检测,结果显示,HP蛋白主要以包涵体的形式高效表达,经HisTrap亲和柱纯化后可形成二聚体结构。通过HBGAs受体结合试验表明,P区与完整病毒衣壳相似,能与唾液中的HBGAs受体发生结合。本研究为进一步开展RHDV衣壳蛋白与受体的相互作用研究奠定基础。 相似文献
5.
与兔出血症病毒VP60蛋白相互作用蛋白的初步鉴定 总被引：1，自引：1，他引：0
为获得与兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)相互作用的细胞蛋白,本研究以pMD-VP60重组质粒为模板扩增RHDV的VP60基因,克隆于表达载体pGEX-6p-1中,构建了重组表达质粒pGEX-VP60,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达GST重组蛋白(rVP60),western blot分析表明该蛋白具有与VP60单克隆抗体(MAb)良好的反应原性。以亲和层析纯化的rVP60进行pull-down实验,从兔的肝脏细胞膜蛋白中获得与VP60相互作用的蛋白,多肽质量指纹图谱分析表明,其相互作用的蛋白为ATP合成酶β亚基,提示该蛋白可能与RHDV的感染相关。 相似文献
6.
为建立兔出血症病毒(RHDV)的血清学检测方法,本实验通过生物信息学分析,将RHDV衣壳蛋白VP60的3个区域VP60-1(aa2-aa208)、VP60-2(aa174-aa425)和VP60-3(aa342-aa579)分别进行原核表达,获得了大小为42 ku、47.5 ku和45.6 ku的重组蛋白。经ELISA和western blot试验分析显示3种重组蛋白均能够被RHDV阳性血清识别,但VP60-1较VP60-2和VP60-3具有更好的反应原性,因此以表达的重组蛋白VP60-1作为包被抗原建立了RHDV间接ELISA抗体检测方法。结果显示,该方法具有较好的敏感性、特异性和重复性,对不同免疫期兔血清的检测结果与HI呈显著相关性。对临床样品的检测结果表明该ELISA方法比HI试验更敏感。本研究以VP60-1为包被抗原建立的ELISA方法可以用于RHDV疫苗的免疫评估。 相似文献
7.
为获得活性良好的兔出血症病毒基因工程抗原,本研究对兔出血症病毒ZB分离株的VP60基因进行了原核表达与初步应用。参照ZB株分离病毒VP60基因序列,设计合成一对特异性引物,PCR扩增长876bp的VP60基因片段。将目的片段定向克隆至pET30a表达载体中,经鉴定正确后,重组质粒转化BL21表达菌,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白,重组蛋白纯化后,Western blot检测表明具有良好的抗原性与特异性,以该蛋白作为诊断抗原,初步建立了检测兔瘟病毒抗体的间接ELISA诊断方法。本研究为RHDV分子流行病学调查提供了参考,为VP60蛋白结构与功能研究、RHDV抗体检测试剂盒及新型疫苗的研制奠定基础。 相似文献
8.
9.
试验旨在通过原核高效表达RHDV VP12蛋白,检测同源组织疫苗免疫后该蛋白抗体的产生情况。RT-PCR扩增获得抗原遗传变异株SQ-1株兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)次要衣壳蛋白VP12基因,定向克隆插入pET32a多克隆位点,构建Trx-His tag融合原核表达载体,PCR与序列测定正确后转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Western blot鉴定分析表达产物活性。测序结果显示,所扩增VP12基因ORF(开放阅读框)为354 bp,编码117个氨基酸,IPTG诱导后目的基因获得表达,融合载体Trx-His tag的重组VP12蛋白分子量为31 ku,与预期一致,且表达蛋白存在可溶性与包涵体两种形式;Western blot结果显示,可溶性表达蛋白与兔瘟肝组织灭活疫苗免疫后攻毒制备的RHDV阳性抗体能发生良好的抗原抗体杂交反应,说明该蛋白具有良好的反应原性。研究结果为开展RHDV VP12蛋白生物学与免疫学特性研究、开发诊断试剂奠定了基础。 相似文献
10.
《中国预防兽医学报》2019,(3)
为研究毕赤酵母表达的兔病毒性出血症病毒(RHDV)病毒样颗粒(VLP)的免疫保护性,本研究将RHDV VP60的基因克隆到pPIC3.5K载体中,并导入毕赤酵母KM71菌株中,重组菌株经发酵和甲醇诱导,通过western blot检测目的蛋白的表达;透射电镜观察表达产物是否组装形成VLP;并通过动物试验评估VLP的免疫原性和攻毒保护效果。Western blot结果显示VP60蛋白能够在酵母内表达,电镜下观察到表达的VP60能够自发装配成大小均一的颗粒,与天然RHDV大小相当,约为30 nm～40 nm,表明表达的VP60可以自发组装成VLP。动物实验结果表明:表达的VLP与佐剂MONTANIDE GEL 01 PR混合后免疫实验兔,能够刺激实验兔产生保护性抗体,免疫后21 d攻毒,对实验兔的保护率达100%,且保护性抗体至少可以持续6个月。本研究利用毕赤酵母表达了RHDV的VLP,为研制RHDV亚单位疫苗奠定了基础。 相似文献
11.
《黑龙江畜牧兽医》2017,(17)
为了用大肠杆菌原核表达系统表达鸡传染性贫血病毒(CIAV)VP2基因片段,并制备其兔抗血清,试验以CIAV M9905株基因组DNA为模板,通过PCR扩增VP2基因,与p ET28a(+)载体连接后转化DH5α获得阳性重组子,将其转化E.coli BL21(DE3)菌,IPTG诱导表达出His-VP2重组蛋白,经Ni-NTA树脂纯化后免疫新西兰白兔制备兔抗血清,采用IFA和Western-blot检测该血清的特异性,ELISA测定其效价。结果表明:重组His-VP2融合蛋白的分子质量约为36 ku,以包涵体形式存在。制备的兔抗VP2血清效价在1∶6 400以上,可特异性结合真核表达的VP2蛋白,表明其反应原性较好。说明试验成功表达VP2蛋白,并制备出兔抗血清,可用于该蛋白与病毒其他蛋白之间的相互作用的进一步研究。 相似文献
12.
试验旨在分离兔出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）镇江株,分析其遗传进化变异,并表达具有良好活性的重组VP60蛋白。通过排除细菌感染、血凝（HA）和血凝抑制（HI）检测、动物攻毒试验与病毒传代、LD50测定等方法,自江苏省镇江市某兔场发病死亡动物肝脏组织样品中分离病原并鉴定;RT-PCR方法获得VP60基因,通过分析VP60基因核苷酸及氨基酸序列研究其遗传进化;将VP60基因与pCold-Sumo载体连接,构建低温诱导、融合Sumo标签原核表达载体,15℃、IPTG诱导表达重组VP60蛋白并对表达产物进行反应原性鉴定。结果显示,分离鉴定获得RHDV ZJ2015毒株,该毒株能凝集人"O"型红血球,HA效价为11log2,其血凝性能被RHDV （AV33）抗血清抑制,该毒株的LD50为10-6.38/mL,具有较强的毒力;RT-PCR扩增得到大小约为1 740 bp的特异性条带,系统进化树分析显示,该毒株属于RHDV1抗原遗传变异株（RHDVa）,与RHDV1和RHDV2 VP60基因核苷酸序列同源性分别为89.4%~97.6%和81.1%~81.5%,氨基酸序列同源性分别为93.8%~98.3%和87.4%~87.6%。构建的低温原核融合表达质粒pCold-VP60在大肠杆菌Rosetta （DE3）中成功表达,通过SDS-PAGE及Western blotting分析,在分子质量74 ku处有特异性表达蛋白条带,且与抗血清发生特异性抗原抗体结合反应,说明重组蛋白具有良好的反应原性。本研究为开展兔病毒性出血症流行病学研究、开发新型重组疫苗与诊断试剂提供参考依据。 相似文献
13.
为分析兔出血症病毒地方分离株的变异情况,并获得活性良好的兔出血症病毒基因工程抗原,对兔出血症病毒ZB分离株的VP60基因进行了克隆、序列分析与原核表达.ZB株分离病毒与GenBank中的6株RHDV VP60基因的核苷酸序列同源性在92.5％～97.9％之间,参照ZB株分离病毒VP60基因序列,设计合成一对特异性引物,PCR扩增了876 bp的VP60基因片段.将目的片段定向克隆至pET30a表达载体中,经鉴定正确后,重组质粒转化BL21表达菌,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白,重组蛋白纯化后,Western blot检测表明具有良好的抗原性与特异性. 相似文献
14.
为筛选与鹅细小病毒VP2和VP3蛋白相互作用的鹅胚成纤维细胞蛋白,构建VP2和VP3蛋白的诱饵载体pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3。从pGEX-4T-VP1质粒中PCR扩增VP2和VP3基因,克隆至pMD-18T载体中,经测序验证鉴定后定向克隆到酵母双杂交载体pGBKT7中。将2个重组诱饵载体经PCR、酶切和测序验证后分别转化酵母菌H2YGold中,检测其在酵母细胞中有无自激活和毒性作用。结果表明:成功构建了pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3诱饵载体,且其对报告基因无自激活作用,对酵母细胞无毒性。由此说明,诱饵载体pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3可用于酵母双杂交系统筛选与VP2和VP3蛋白相互作用的细胞结合蛋白。 相似文献
15.
《中国畜牧兽医》2018,(12)
试验旨在分离兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)镇江株,分析其遗传进化变异,并表达具有良好活性的重组VP60蛋白。通过排除细菌感染、血凝(HA)和血凝抑制(HI)检测、动物攻毒试验与病毒传代、LD50测定等方法,自江苏省镇江市某兔场发病死亡动物肝脏组织样品中分离病原并鉴定;RT-PCR方法获得VP60基因,通过分析VP60基因核苷酸及氨基酸序列研究其遗传进化;将VP60基因与pCold-Sumo载体连接,构建低温诱导、融合Sumo标签原核表达载体,15℃、IPTG诱导表达重组VP60蛋白并对表达产物进行反应原性鉴定。结果显示,分离鉴定获得RHDV ZJ2015毒株,该毒株能凝集人"O"型红血球,HA效价为11log2,其血凝性能被RHDV(AV33)抗血清抑制,该毒株的LD50为10-6.38/mL,具有较强的毒力;RT-PCR扩增得到大小约为1 740bp的特异性条带,系统进化树分析显示,该毒株属于RHDV1抗原遗传变异株(RHDVa),与RHDV1和RHDV2VP60基因核苷酸序列同源性分别为89.4%～97.6%和81.1%～81.5%,氨基酸序列同源性分别为93.8%～98.3%和87.4%～87.6%。构建的低温原核融合表达质粒pCold-VP60在大肠杆菌Rosetta(DE3)中成功表达,通过SDS-PAGE及Western blotting分析,在分子质量74ku处有特异性表达蛋白条带,且与抗血清发生特异性抗原抗体结合反应,说明重组蛋白具有良好的反应原性。本研究为开展兔病毒性出血症流行病学研究、开发新型重组疫苗与诊断试剂提供参考依据。 相似文献
16.
为验证本实验室前期实验中初步鉴定的兔铁蛋白重链(FTH)与兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)具有相互作用关系,本研究采用RT-PCR技术从兔肝脏扩增编码FTH基因,并将其克隆至pET-32a(+)中转化大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS中进行表达.重组FTH蛋白(rFTH)经IPTG诱导获得表达,采用Ni-NTA Agarose纯化rFTH.利用纯化的VP60作为ELISA包被抗原检测FTH与VP60的相互作用.结果表明,ELISA检测的OD490nm值与FTH蛋白量呈正相关.本研究进一步验证了FTH与VP60具有相互作用关系. 相似文献
17.
兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果 总被引：2，自引：1，他引：1
用RT—PCR方法扩增兔出血症病毒（RHDV）衣壳蛋白VP60基因,通过克隆、转化得到重组穿梭载体Bacmid—VP60,用此质粒转染Sf9昆虫细胞,得到重组病毒rAcV—Bac—VP60,经RT—PCR、IFA、SDS-PAGE、Western blotting、HA和HI鉴定,结果显示重组VP60蛋白在Sf9昆虫细胞中得到表达。在不加任何佐剂的情况下,用表达的蛋白免疫3月龄非RHD免疫兔,结果显示,免疫后21天,兔体内可产生抗RHDV抗体,抗体血凝抑制效价为2^6～2^7,该抗体可以抵抗血凝效价为2^10致死剂量RHDV强毒的攻击,本研究为兔病毒性出血症基因工程疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
18.
《中国预防兽医学报》2015,(8)
流感病毒的NS2蛋白能够介导病毒核糖核蛋白复合体(v RNP)的核输出过程,而且可以调控病毒聚合酶的活性,参与禽流感病毒在哺乳动物宿主体内的适应过程。为鉴定与NS2相互作用的宿主蛋白,本研究利用流感病毒NS2蛋白作为"诱饵"蛋白,通过经典酵母双杂交系统筛选与其相互作用的宿主蛋白,并利用免疫共沉淀(Co-IP)和GST pull-down方法进一步验证其相互作用关系。结果表明,通过酵母双杂交系统筛选含有Calu-3、A549、THP-1和U251 4种细胞的c DNA文库,共筛选到7种蛋白,分别为HGS、EXOSC4、ZWINT、PRDX3、IRF3、NDUFB9和RMND5B,根据Gene Ontology分析结果表明,这些蛋白分别参与细胞生长发育、细胞代谢和细胞定位等过程。其中对过氧化物氧还酶3(PRDX3)进行了Co-IP和GST pull-down试验证实重组表达的NS2蛋白和PRDX3蛋白在293T细胞中存在特异性的相互作用。本研究为进一步研究两者之间相互作用如何影响NS2蛋白功能以及病毒的复制周期奠定了基础。 相似文献
19.
为建立一种快速的兔病毒性出血症病毒抗体检测方法,本研究以原核表达的重组VP60蛋白作为诊断抗原,建立了检测兔病毒性出血症病毒抗体的VP60-ELISA诊断方法。该方法检测3种常见兔病(兔轮状病毒、仙台病毒和魏氏梭菌)的阳性血清均为阴性;检测灵敏度为1:12800;批内、批间重复性试验的变异系数分别小于4.9%和6.9%。本研究建立的RHDV VP60-ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为RHDV的抗体检测及流行病学调查等快速诊断提供了一种技术手段。 相似文献
20.
为了研究鸡传染性贫血病毒(Chicken anemia virus,CIAV)VP3蛋白与病毒自身蛋白之间的相互作用,需对该蛋白进行原核表达制备相应兔源抗血清,试验通过提取CIAV M9905株基因组DNA,PCR扩增出VP3基因,构建重组质粒pET30a(+)-VP3,然后转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,进一步通过IPTG诱导表达后用Ni-NTA亲和柱纯化获得融合蛋白,经SDS-PAGE分析后对融合蛋白进行乳化,免疫新西兰兔制备抗血清,并对其进行ELISA效价测定、Western-blot及IFA检测。结果表明:SDS-PAGE分析证实获得高纯度的重组蛋白VP3,大小约为22 ku,且其在大肠杆菌中主要以包涵体的形式存在;ELISA法检测制备的兔源抗VP3血清效价在1∶6 400以上;经Western-blot及IFA检测证实,VP3兔源血清可特异性结合Vero细胞表达的VP3蛋白。说明试验成功表达出CIAV VP3蛋白,制备的兔抗血清具有较好的特异性。 相似文献