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依据GenBank中登录的坏死梭杆菌外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)基因序列,设计1对引物进行PCR扩增OMP片段并克隆至pET-28a中,构建原核表达重组质粒pET-28a-OMP。将pET-28a-OMP转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,表达含2个His的重组蛋白。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,该重组蛋白分子质量为93 ku,为包涵体表达,具有反应原性。本试验结果为坏死梭杆菌OMP免疫机制的研究提供了基础数据。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2016,(7)
为了解坏死梭杆菌白细胞毒素的致病机制,本研究将实验室前期构建的坏死梭杆菌白细胞毒素基因部分融合基因的真核表达质粒(p PIC9K-bsbse-gas-sh)转化毕赤酵母KM71H细胞,1%甲醇诱导其表达目的蛋白;SDS-PAGE结果显示,甲醇诱导3 d后,重组BSBSE-GAS-SH蛋白以分泌形式表达于培养物上清液中,分子量约为117.9 ku;western blot表明重组蛋白能够与抗BSBSE抗血清发生反应,具有良好的反应原性;细胞毒性试验表明重组蛋白对小鼠肝细胞和巨噬细胞均具有细胞毒性作用,并且具有剂量依赖性,其中重组蛋白对小鼠巨噬细胞的细胞毒性作用更强。本研究为揭示坏死梭杆菌白细胞毒素致病机制提供了相关的实验数据。 相似文献
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坏死梭杆菌是动物和人的各种坏死化脓感染的条件性致病菌.坏死梭杆菌的白细胞毒素是一种高度不稳定性分泌蛋白,被认为是主要的毒力因子.坏死梭杆菌白细胞毒素基因的开放阅读框(lktAORF)包括9 726 bp,编码3 241个氨基酸,总分子质量为336 ku的蛋白,且与其他细菌的细胞毒素没有任何相似的序列.覆盖在整个坏死梭杆菌lktA ORF上的5个短的重叠的多肽分别是BSBSE,SX,GAS,SH和FINAL,将它们在大肠埃希菌中表达,所有的多肽都有免疫原性,但GAS引起最小的抗体反应,BSBSE和SH对坏死梭杆菌攻击诱导产生了很强的保护力,比坏死梭杆菌的培养上清内全长活性lkt或无活性上清的保护性要好得多. 相似文献
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《中国预防兽医学报》2016,(8)
为筛选副猪嗜血杆菌血清13型分离株ZJ1018具有免疫原性的外膜蛋白,本研究从该分离菌提取外膜蛋白进行双向电泳分离,并进行免疫印迹分析。共对21个蛋白点进行质谱分析,通过NCBI数据库搜索,共对应14种蛋白,包括7种外膜蛋白。其中OmpA、palA、D15为与血清5型菌株共有的免疫原性蛋白,D15蛋白在不同血清型菌株中氨基酸序列同源性不低于99.4%;蛋氨酸ABC转运体底物结合蛋白、GS60、外膜脂蛋白A属于在副猪嗜血杆菌中被筛选出的新的免疫原性外膜蛋白。本研究为副猪嗜血杆菌亚单位疫苗的开发提供了新的依据。 相似文献
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为研究副鸡禽杆菌外膜囊泡(OMVs)的构成,提取A型副鸡禽杆菌的OMVs,纯化并透射电镜观察其形态结构,检测其内毒素含量和DNA含量,分析其是否具有血凝活性,测定OMVs蛋白含量,并用质谱法分析了OMVs的蛋白组成成分。结果显示,副鸡禽杆菌的OMVs呈球形、泡状,直径为20 nm～300 nm,含有内毒素和少量核酸物质。该OMVs不能凝集鸡红细胞,Western blot结果表明,OMVs蛋白与该菌外膜蛋白单克隆抗体有阳性反应,构成OMVs的蛋白分子质量大多集中于65 ku和13 ku处,蛋白成分主要有ATP依赖性RNA解旋酶等多种功能酶、铁链霉素B受体、膜蛋白等结构成分和一些未知功能的假定蛋白等,为进一步分析副鸡禽杆菌外膜囊泡在致病和免疫方面的作用奠定基础。 相似文献
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为了解禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)分离菌株的荚膜血清型、菌体血清型与外膜蛋白型之间的相关性,首先对自行分离的10个菌株采用间接血凝试验和琼脂扩散试验进行鉴定(均为A:1);然后采用超声波破碎、高速离心和十二烷基肌氨酸钠提取外膜蛋白,通过SDS-PAGE电泳的方法对上述10个菌株与C48-1(A:1)、X73(A:1)、P1059(A:3)、CU(A:3,4)等一起进行外膜蛋白(Outer membrane proteins,OMP)分型研究。结果表明:14个禽多杀性巴氏杆菌菌株以2个主要蛋白OmpH和OmpA的差异为依据分为3种主要OMP型;依据次要蛋白的差异,OMP-1,3菌株进一步分为OMP型1.1,1.2和3.1,3.2,其中OMP型1.1有6个菌株,OMP型1.2有5个菌株;OMP型2有1株(YZ7031);P1059为OMP型3.1;CU为OMP型3.2;另外,血清型为A:1的12个菌株中有11个菌株外膜蛋白型均为OMP-1型,血清型为A:3、A:3,4的菌株外膜蛋白型属于3型。说明禽多杀性巴氏杆菌血清型与特定的外膜蛋白型具有很强的相关性。 相似文献
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坏死梭杆菌研究进展 总被引：1，自引：0，他引：1
坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum,Fn)是一种严格厌氧的革兰阴性多形态杆菌,其致病因子包括内毒素、白细胞毒素、血小板凝集因子、血凝素和溶血素等,其中主要的致病因子是白细胞毒素。由坏死梭杆菌引起的疾病在不同国家和地区均有发生,鹿、羊等反刍动物感染坏死梭杆菌时表现为跛行,关节肿大,肝脓肿和腐蹄病,猪、马等动物感染坏死梭杆菌时主要表现为跛行,严重时继发其他细菌感染,对养殖业造成巨大损失;人类感染该细菌时表现为急性咽炎综合征(Lemierres syndrome)。论文通过对国内外坏死梭杆菌及其疫苗研究和新型佐剂的开发进行综述,以期为该细菌疫苗的研制提供参考。 相似文献
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牛腐蹄病坏死梭杆菌H05菌株白细胞毒素基因的原核表达及其免疫活性分析 总被引：1，自引：1，他引：1
参考羊腐蹄病坏死梭杆菌白细胞毒素蛋白的抗原表位基因序列,利用DNAStar软件预测了牛腐蹄病坏死梭杆菌白细胞毒素蛋白的5个抗原表位区,设计5对在上游和下游含有特异性限制性内切酶的引物,以牛腐蹄病坏死梭杆菌H05菌株白细胞毒素基因阳性质粒pMD18-T-lkrA为模板,PCR扩增了预测的5个抗原表位区基因,分别命名为PL1、PL2、PL3、PL4和PL5,将其定向克隆到原核表达载体pGEX-6p-1和pPROEX HTa后转化E.coli BL21(DE3),37℃条件下,用IPTG诱导表达,结果PL1、PL2、PL4和PL5在pGEX-6p-1中获得了表达,而PL3在pPROEX HTa中获得了表达。Westem blot试验结果表明,牛腐蹄病坏死梭杆菌H05菌株白细胞毒素蛋白5个抗原表位区的重组蛋白PL1、PL2、PL3、PL4和PL5均与坏死梭杆菌多克隆血清反应。 相似文献
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Four pairs of primers containing BamHⅠ and XhoⅠ sites were designed for amplification of 43 ku outer membrane protein （43K OMP） of bovine Fusobacterium necrophorum strain H05 according to the GenBank. The PCR products of the truncated 43K OMP genes were digested with BamHⅠ and XhoⅠrestriction endonuclease, and then the digested products were ligated to the pET-32a vector with His tag. The positive plasmids of four truncated 43K OMP genes were transformed into E.coli BL21(DE3). Protein expression of four truncated 43K OMP genes were induced using 1.0 mmol/L IPTG. The result indicated that the four truncated 43K OMP genes were successfully expressed in E.coli, and molecular weights of the expressed proteins were all about 30 ku. This study would provide some basis for further research of immunogenicity of the outer membrane protein of Fusobacterium necrophorum. 相似文献
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The capacity of extracts from toxigenic and non-toxigenic ruminant strains of Fusobacterium necrophorum to protect against challenge with homologous and heterologous bacteria was examined in mice. The numbers of F. necrophorum which were infective or lethal for mice increased 5- to 8-fold in animals which had been previously inoculated with complete Freund's adjuvant (FCA). Although preparations containing lipopolysaccharide (LPS) and outer membrane proteins (OMP) from several strains gave protection against a non-toxigenic strain (FnB-3), they did not significantly immunize mice against a challenge infection with a toxigenic bovine strain, FnB-1. Only material which had been prepared by gel filtration of 18-h liquid culture supernates of toxigenic F. necrophorum elicited significant immunity against homologous challenge with FnB-1. This preparation contained LPS and the majority of the leucotoxic activity. However, passive protection was not afforded to mice inoculated with bovine or rabbit sera which possessed high neutralization titres against the leucocidin. 相似文献
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鹿源坏死梭杆菌毒力菌株FN（AB）94实验动物感染模型的建立 总被引：5，自引：1，他引：4
将坏死梭杆菌FN（AB）94分离株以10^6,10^7,10^8,10^9 个/mL等不同菌量，于耳后根颈部皮下分别接种于4组的健康实验家兔，每组3只，逐日观察感染家兔的发病情况，结果，10^8,10^9个／mL，菌量感染组家兔，在接种后9－68 d内先后死亡，68d死亡家兔的病理变化明显，并从死亡家兔内脏及脓法叶，应用触片及分离培养均检到长丝状及小杆状等形态典型的坏死梭杆菌，10^7个/mL感染家兔仅表现体重减轻，10^6个／mL感染家兔无明显临床表现，由此表明，坏死梭杆菌FN（AB）94分离株具有很强的感染毒力，对家兔的最小致死量为10^8个／mL，耳后板颈部皮下接种是适宜的感染途径，从而建立了坏死梭杆菌分离株实验动物感染模型。 相似文献
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布鲁氏菌外膜蛋白OMP15.6表达及免疫反应原性测定 总被引：2，自引：0，他引：2
表达羊布鲁氏菌16M预测外膜蛋白OMP15.6,探索其作为诊断抗原的可能性。采用降落PCR方法,从羊布鲁氏菌16M基因组DNA中扩增出423bp的基因片段,将该片段克隆于原核表达载体PGEX-4T-2,构建重组表达载体。经IPTG诱导,SDS-PAGE检测,结果表明,在大肠杆菌中成功表达了外膜蛋白OMP15.6。经West-ern-blotting检测,该蛋白能与豚鼠抗布鲁氏菌阳性血清发生特异性免疫反应,为其之后的抗原性以及免疫原性研究奠定了良好的基础。 相似文献
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为分离纯化奶牛腐蹄病坏死杆菌,分析其与其他菌株的亲缘关系,本研究利用坏死杆菌白细胞毒素特异性引物,对奶牛腐蹄病病牛蹄部拭子样品进行了PCR检测,利用厌氧培养基对PCR检测阳性样品进行了坏死杆菌的分离培养,以分离的坏死杆菌基因组DNA为模板,对白细胞毒素基因进行了克隆和序列分析。结果显示,9份奶牛腐蹄病病牛蹄部拭子样品PCR检测结果均为阳性,对其中一份样品中的坏死杆菌进行分离培养,获得了纯培养物,命名为bFR13-1。坏死杆菌bFR13-1菌株白细胞毒素基因测序结果显示,与GenBank已发表的H05、A25和B35菌株的白细胞毒素基因在核苷酸水平的同源性分别为98.40%、98.35%和90.79%,推导氨基酸的同源性分别为97.7%、97.6%和89.0%。进化树分析结果显示,坏死杆菌bFR13-1菌株白细胞毒素与H05菌株的同源性最高,bFR13-1菌株与H05菌株和A25菌株呈较近亲缘关系。结果表明,不同坏死杆菌分离株的白细胞毒素呈现一定的变异性,这种变化是否与坏死杆菌致病性相关,值得深入研究。 相似文献
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GAO Jing LI Chun-qiu YAO Shuang ZHANG Li-chun WANG Xin-yu WANG Zhi-hui ZHAO Xi-wen WEI Shan WANG En-yu SUN Dong-bo WU Rui GUO Dong-hua 《中国畜牧兽医》2015,42(9):2308-2312
For separation and purification of Fusobacterium necrophorum of cow footrot, and analysis of genetic relationship with other strains, the hoof ministry swab samples were detected by PCR based on specific primers of leukotoxin gene, and genomic DNA were isolated from PCR positive samples of Fusobacterium necrophorum culturing in anaerobic medium.The genes of leukotoxin were cloned and sequenced.The results showed that nine of hoof ministry swab samples were all PCR positive samples, and we obtained Fusobacterium necrophorum pure culture from one of the samples which named bFR13-1.The gene sequencing results indicated that the homologies of leukotoxin gene nucleotide sequence of bFR13-1 strain compared with H05, A25 and B35 strains from GenBank were 98.40%, 98.35% and 90.79%, respectively, and the homologies of deduced amino acid sequence were 97.7%, 97.6% and 89.0%, respectively.Phylogenetic tree analysis results showed that leukotoxin gene of Fusobacterium necrophorum bFR13-1 and H05 had high homology and bFR13-1, H05 and A25 showed a close genetic relationship.The result indicated that leukotoxin showed variability between different Fusobacterium necrophorum isolated strains, and it was worth to study whether this change and pathogenicity of Fusobacterium necrophorum were related. 相似文献
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Ribosome-rich extracts (RRE) were prepared by differential and ultracentrifugation from 25 bovine and 6 ovine isolates of Fusobacterium necrophorum (FN) including both biotypes A and B. A pooled rabbit antiserum was prepared against whole-cell and sonicated whole-cell bacterins of F necrophorum isolate FN 3080, and a 2nd pooled rabbit antiserum was prepared against a RRE of FN 3080. The RRE of the 25 bovine isolates were tested against the FN 3080 whole-cell antiserum, using Ouchterlony double-immunodiffusion procedures. One to 3 precipitin lines were observed with the 25 isolates. The individual bovine isolates were found to have lines of identity with 5 to 21 of the other 24 isolates. The 25 bovine isolates and the 6 ovine isolates were then compared, using the FN 3080 RRE antiserum. One to 3 precipitin lines were observed for the 31 isolates with the RRE antiserum, and lines of identity were observed between all 31 of the isolates. These results indicated that common antigens are present in the RRE from a wide variety of F necrophorum isolates including both A and B biotypes. 相似文献
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坏死梭杆菌FN(A)p2001株小鼠感染模型的建立 总被引：1，自引：1，他引：1
将鹿源坏死梭杆菌FN(A)p2001分离株以3×108、3×107、3×106、3×105、3×104、3×103个/只等不同菌量,分别接种于6组小鼠,每组10只,逐日观察小鼠感染情况.结果表明,3×106、3×107、3×108个/只菌量感染组小鼠,在接种后3 d～8 d先后死亡,5 d后死亡小鼠的病理变化明显,并从死亡小鼠内脏及脓汁中均检到长丝状及小杆状等多形态典型的坏死梭杆菌;3×104个/只和3×105个/只菌量感染仅表现体重减轻,3×103个/只菌量感染无明显临床表现.由此表明,坏死梭杆菌FN(A)P2001分离株具有很强的感染毒力;对小鼠的最小致死量为106个/只菌量;腹腔接种是适宜的感染途径.从而建立了坏死梭杆菌分离株小鼠感染模型. 相似文献
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为揭示副猪嗜血杆菌外膜蛋白与毒力的关系,采用SDS-PAGE测定了82个副猪嗜血杆菌分离株细胞外膜蛋白(OMP),比较了不同临床背景分离株的OMP表型差异,根据外膜蛋白的电泳迁移率Rf值和蛋白含量对OMP与毒力菌株的相关性和PAGE分型进行了聚类分析。图谱表型分析结果表明,82个分离株分成以相对分子质量36～40ku为特征的Ⅰ型和以42～45ku为特征的Ⅱ型2种类型,约34%患病猪分离株属于PAGEⅠ型,只有8.7%健康猪分离株属于PAGEⅠ型。Rf值聚类分析结果显示外膜蛋白分为3种类型,PAGEⅠ、PAGEⅡ和PAGEⅢ型。图谱蛋白含量聚类分析显示5个PAGE型。结果提示,36～40ku蛋白与菌株的毒力相关。 相似文献