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猪链球菌1、7、9型多重PCR诊断方法的建立及初步应用 总被引：3，自引：3，他引：0
为了建立猪链球菌（Streptococcus suis,SS）1、7、9型（SS1、SS7、SS9）的快速鉴别诊断和分型方法,本研究根据GenBank已登录的SS1型特异性的CPS1I基因、7型CPS7H基因、9型CPS9H基因设计引物,以标准SS1、SS7、SS9株基因组DNA为模板,建立了SS1、SS7和SS9的多重PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的多重PCR检测方法对11份猪链球菌的临床分离纯化菌株进行了的应用检测。结果表明,成功建立了SS1、SS7和SS9的多重PCR检测方法,该方法的检测灵敏度可达100 CFU/mL,特异性和重复性好;利用多重PCR检测方法对11份猪链球菌临床分离纯化菌株检测结果表明,11份样品中有3份样品为SS9阳性、2份样品为SS7阳性、1份样品为SS1阳性。本研究为临床上SS1、SS7、SS9的快速鉴别诊断提供了一种新方法。 相似文献
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猪链球菌通用型和2型双重荧光定量PCR快速检测技术的建立和应用 总被引：2，自引：0，他引：2
为快速区分检测猪链球菌血清型2型和其他血清型,以猪链球菌的保守基因gdh和2型特异性基因cps2J为靶基因设计引物和TaqMan探针,建立猪链球菌通用型和2型特异性的双重荧光定量PCR检测方法,并与常规PCR方法一起对临床样品进行检测。结果显示:本方法在1.5h内可完成猪链球菌和2型猪链球菌同时检测,与其他细菌无交叉反应;检测灵敏度可达5拷贝数,标准曲线相关系数大于0.999,批内和批间CV均小于1.25%。对67份临床样品检测显示猪链球菌和2型猪链球菌检出率分别为79.1%和35.8%,与常规PCR检测结果的符合率为92.5%和89.6%,kappa值为0.800和0.757,具有极好的一致性。成功建立了灵敏、特异和稳定的双重荧光定量PCR方法,实现了猪链球菌和2型猪链球菌同时及快速诊断。 相似文献
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为快速诊断和检测猪链球菌病,根据GenBank中已登录的猪链球菌抗原基因保守区域序列,设计并合成特异性引物及Taqman探针,通过优化荧光定量PCR反应体系及扩增条件,构建了快速、准确检测猪链球菌的Taqman荧光定量PCR检测方法(Taqman FQ-PCR),测定了该方法的灵敏性、重复性和特异性,并对疑似猪链球菌临床感染样本进行了检测。结果显示:所建立的Taqman FQ-PCR方法检测灵敏度为1×10~2拷贝/μL;对3种不同浓度的猪链球菌重组质粒进行3次重复扩增,变异系数均小于3%,说明重复性好;特异性检测显示,只有猪链球菌样本的扩增曲线呈阳性反应,其他致病菌均无荧光信号;采用此方法,对30份临床疑似猪链球菌感染样本进行检测,发现有27份样本为阳性,比采用国标法检测得到的结果更加灵敏。结果表明,建立的FQPCR方法具有灵敏性高、重复性好、特异性强等特点,可用于猪链球菌的快速诊断和检测。 相似文献
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为建立猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因缺失疫苗和野毒感染的快速鉴别诊断方法,本研究根据猪伪狂犬病野毒具有gD表面抗原基因和gE毒力基因,而基因缺失疫苗只有gD基因无gE基因的特性,针对gD/gE基因的5'端核苷酸序列自行设计引物,建立鉴别PRV gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了检测.结果表明,成功建立了鉴别PRV gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法,该方法灵敏度高,最低检出限为100拷贝/μL;重复性好;特异性强,可特异性地扩增出PRV细胞毒中的gD和gE基因及gE基因缺失疫苗毒中的gD基因,但对PK-15细胞和猪流行性腹泻病毒等其他8种病原扩增不出任何条带;自835份临床疑似PRV感染病料中共检测出PRV gD和gE基因双阳性样品即野毒感染阳性样品267份,PRV gD基因单阳性样品28份,选取该方法检测出的26份PRV野毒感染阳性样品用于病原分离培养,两种方法的符合率为96.1%.说明本试验建立的二重PCR鉴别诊断方法快速、灵敏、特异,对于临床上疫苗毒和野毒感染的快速鉴别诊断具有重要意义. 相似文献
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从全国部分猪场采集疑似猪链球菌感染病例脑样品20份进行细菌分离,成功分离到10株细菌,通过猪链球菌及血清类型鉴定,最终确定其中一株为2型猪链球菌。应用猪链球菌7种主要毒力因子特异性基因扩增检测方法检测所分离到的2型猪链球菌的毒力因子分布情况,并应用小鼠攻毒试验对其致病性进行观察研究。结果表明:分离的2型猪链球菌具备7种毒力因子;动物试验表明SS2能引起小鼠的急性败血症及脑膜炎;细菌回归试验结果表明,试验组死亡小鼠的脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏均有细菌定植,且能分离出攻毒菌。此分离菌株的研究为研制2型猪链球菌病疫苗奠定了基础。 相似文献
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猪链球菌2型多重PCR检测方法的建立及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
设计3对引物,分别扩增链球菌属特异性gdh、猪链球菌种特异性16S rRNA和猪链球菌2型特异性cps2J等基因,目的片段大小分别为725bp、523bp和387bp。利用合成的3对引物并通过对反应条件与反应体系的优化建立了多重PCR。应用该多重PCR检测了分离到的链球菌1105株,检出猪链球菌667株,猪链球菌2型33株。研究结果表明,该方法特异性高、敏感性强,可广泛应用于猪链球菌病的快速诊断及流行病学调查。 相似文献
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猪链球菌2型三重PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：1，他引：1
针对猪链球菌2型gdh、mrp及cps2J基因设计3对引物,建立了该菌的三重PCR方法。30μL反应体系中3组引物gdh1、gdh2,mrp1、mrp2及cps2J1c、ps2J2的最适浓度比为1∶1∶1.67。最佳反应条件为94℃3 min;94℃1 min,55℃40 s,72℃50 s,30个循环;72℃5 min。可扩增到目的基因gdh、mrp及cps2J的片段大小分别为689、532和457 bp;猪链球菌2型BHI培养物的检测下限为450 CFU;猪肉人工污染样品经4 h增菌,其检测下限仅为4 500 CFU。以上结果显示,该三重PCR方法可用于组织样品和纯培养物中猪链球菌2型的检测,具有快速、特异和简便的特点。 相似文献
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猪链球菌是猪的一种重要病原菌,并且也会引起人的链球菌病。有35个荚膜血清型(1/21、~34),通常自发病或死亡猪体分离获得1,2,7,9型和14型菌株,其中2型是毒力最强的血清型。根据已知猪链球菌16 SrRNA及溶血素(sly)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、荚膜多糖(cps)、胞壁蛋白或溶菌酶释放相关蛋白(mrp)、胞外因子(epf)编码基因序列设计特异性引物,建立猪链球菌群和1(14),2(1/2),7型和9型特异性PCR或多重PCR,建立2型致病性菌株和1型高致病性菌株毒力鉴定PCR或多重PCR,用于检测和鉴别临床病料和细菌分离物中的猪链球菌,具有高敏感性和高特异性,与其他致病菌及其他血清的猪链球菌型无交叉反应,为疫病诊断及流行病学的研究提供了快速、简便和有用的工具。 相似文献
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为建立高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP/LP-PRRSV)快速鉴别诊断方法,本研究根据GenBank已登录的HP-PRRSV与LP-PRRSV的Nsp2基因序列,分别设计了特异性的上游引物(HP-Upper-p1/LP-Upper-p2) 和共用下游引物(Co-Lower-p3)。以HP-PRRSV和LP-PRRSV混合物总RNA为反转录模板,建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV的二重RT-PCR检测方法;并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了检测。结果显示,本试验成功建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV二重RT-PCR检测方法,该方法灵敏度高,最低检出限均为100拷贝/μL;重复性好,特异性强,可特异性地扩增HP-PRRSV细胞培养物和LP-PRRSV疫苗毒,但对Marc-145细胞和其他8种病原对照扩增不出任何条带;自25份临床疑似PRRSV感染病料中共检测出了21份PRRSV阳性样品,其中HP-PRRSV阳性样品共计20份,LP-PRRSV阳性样品4份。结果表明,本研究成功建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV二重RT-PCR检测方法,可适用于高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征的快速鉴别诊断。 相似文献
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猪链球菌9型cps9G基因的克隆与序列分析 总被引：5，自引：3，他引：2
根据GenBank中猪链球菌9型(SS9)基因的核酸序列,设计一对引物,采用PCR方法从确诊为猪链球菌的阳性样品中扩增cps9G基因片段,将其克隆到pMD18-T载体上,转化DH5a感受态细胞,提取重组质粒pMD18T-cps9G,经PCR和酶切鉴定后测序,并与GenBank上SS9相应序列进行同源性分析.结果表明,经PCR扩增,鉴定为SS9的有8株.序列分析发现,8株SS9的cpsgG片段的核苷酸序列较稳定,该基因片段长度均为562 bp,彼此间的核苷酸同源性达96.8%～99.8%,亲缘关系密切;与GenBank上已发表的SS9参考毒株的同源性介于96.0%～98.6%. 相似文献
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Silva LM Baums CG Rehm T Wisselink HJ Goethe R Valentin-Weigand P 《Veterinary microbiology》2006,115(1-3):117-127
Definition of virulent Streptococcus suis strains is controversial. One successful approach for identification of virulent European strains is differentiation of capsular serotypes (or the corresponding cps types) and subsequent detection of virulence-associated factors, namely the extracellular factor (EF, epf), the muramidase-released protein (MRP, mrp) and the hemolysin suilysin (SLY, sly). In this work we present a novel multiplex PCR (MP-PCR) and an mrp variant PCR for identification and characterization of virulent S. suis strains. These new methods were used to identify association of disease with particular profiles of virulence-associated genes. The MP-PCR allowed identification of S. suis through detection of the housekeeping gene gdh, differentiation of four cps types (1, 2, 7 and 9), and detection of epf, mrp, sly and arcA (arginine deiminase from S. suis). Furthermore, this study describes the first PCR assay for differentiation of at least six mrp variants. Expression of the corresponding size variants of MRP was shown for four of the six mrp variants, but was undetectable for the two larger mrp variants in the particular strains investigated. The results of this study suggest that cps7 strains are associated with pneumonia and that variation of mrp is very pronounced among these strains. Gene profiles of invasive, pneumonia and carrier S. suis isolates by combination of PCR assays allowed differentiation of 24 different genotypes among cps1, 2, 7 and 9 strains. Forty-five percent of the invasive S. suis diseases investigated in this study were caused by only two of these genotypes, namely cps2/mrp+/epf+/sly+ and cps9/mrp(*)/epf-/sly+. Thus, this study demonstrates for the first time a uniform profile of the particular virulence-associated genes for the vast majority of the investigated invasive cps9 strains. 相似文献
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为了解血清2型猪链球菌(S.suis2)河南分离株的毒力基因型及cps2j全基因突变情况,本研究扩增S.suis2毒力基因gdh、cps2j、mrp、ef 、sly、orf2和fbps,并对s.suis2的cps2j进行全基因序列测定和同源性分析.结果表明,gdh、cps2j、mrp、ef、sly、orf2和fbps基因在8个S.suis2分离株中的检出率分别为100％(8/8)、100％(8/8)、62.5％(5/8)、75％(6/8)、87.5％(7/8)、100％(8/8)和100％(8/8);其中cps2j全基因核苷酸及推导的氨基酸序列与来源不同的S.suis2分离株同源性分别达98％和97％以上,以该基因构建的系统发育树表明8株S.suis2河南分离株与国内外不同参考株同源性高,亲缘关系密切. 相似文献
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为了解9型猪链球菌广东分离株毒力因子基因型、基因变异和进化情况，本试验采集发病猪脑脊液、关节液、脾脏、肝脏、淋巴结进行细菌分离培养和生化鉴定，采用PCR方法鉴定其血清型及部分毒力基因，对cps9D、gdh、gapdh与orf2基因进行序列测定和分析，并构建系统发育树。结果显示，分离菌镜检为革兰氏阳性链状球菌，在鲜血琼脂平板中呈β溶血，可发酵大多数糖类，能成功扩增cps9D基因，含重要的保守基因gdh及毒力基因gapdh和orf2，表明分离菌株为9型猪链球菌。分离菌株cps9D、gdh、gapdh、orf2基因核苷酸序列与GenBank上国内外参考菌株的同源性分别为95.9%~100.0%、98.6%~99.8%、98.7%~99.6%和95.5%~99.9%，说明分离菌株与国内外其他9型猪链球菌毒株核苷酸同源性都较高，且与国内外的流行毒株基本一致，未发生太大的变异。系统发育树表明，分离株与国内外来源不同的猪链球菌分离株同源性高，亲缘关系密切。 相似文献
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为了解猪链球菌在新疆南疆地区正常猪群中的流行情况,对库尔勒地区、阿克苏地区、喀什地区无菌采集的286头份健康屠宰猪的扁桃体进行猪链球菌种的鉴定;采用猪链球菌谷氨酸脱氢酶（gdh）基因设计引物,建立PCR方法。结果表明,南疆地区猪链球菌的携带率达到了17．13％;对携带猪链球菌的扁桃体进行细菌的分离鉴定,荻得47株猪源性链球菌;采用多重PCR对分离的47株猪链球菌进行主要致病血清学的检测,未见主要致病血清型。 相似文献