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依据GenBank登录的鸭肠炎病毒(DEV)核苷酸序列设计引物,利用长片段PCR技术扩增了DEV基因组UL36与UL43基因之间的未知序列,扩增所得片段长度约为15 kb.经EcoRV单酶切,将其中的3.9 kb片段克隆到pUC18中.序列分析表明该3.9 kb EcoR V片段含有2个完整的转录方向相反的与单纯疱疹病毒(HSV)UL41和UL42基因同源的ORF,命名为DEV UL41和ULA2基因.通过氨基酸序列比对发现:DEV UL41基因含有5个高度保守位点,而UL42含有2个,进化树分析表明DEV与疱疹病毒科a疱疹病毒亚科的马立克病毒、火鸡疱疹病毒的进化关系非常相近,为DEV的分类提供了参考依据. 相似文献
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伪狂犬病病毒Ea株UL31基因克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增含UL31基因的1 000bp片段,扩增产物克隆于pMD18-T中,双脱氧末端终止法序列测定.通过OM1GA2.0软件包分析发现,Ea株UL31基因编码271个氨基酸,蛋白质分子量为30.38 kD,与Ka株UL31基因核苷酸与氨基酸序列同源性均在98%以上.将α-疱疹病毒亚科9个不同成员UL31同源基因编码的氨基酸序列进行多重比对分析,发现4个保守的功能性结构域.将该片段插入原核表达载体pGEX-KG中GST下游,构建的原核表达质粒pGEX-UL31在大肠杆菌BL32(DE3)中获得了高效表达,SDS-PAGE结果显示,表达的融合蛋白质分子量为56 kD. 相似文献
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鸭瘟病毒UL47基因克隆及其分子特性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
通过测定本实验室构建的鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)DNA基因文库中重组质粒的DNA序列,结合NCBI的ORF Finder和Blast工具分析得到了该病毒UL47基因的ORF。采用PCR扩增出了UL47基因并将其克隆到pMD18-T载体上,经PCR和酶切鉴定以及进一步的核酸斑点杂交试验证实该基因即为DPV UL47基因。利用生物信息学软件ProtScale、SignalP3.0、Scansite、TMpred、Prosite、DNAStar以及在线的EMBOSS等分析了UL47基因的分子特性。结果显示,该基因大小为2 367bp,编码788aa,而且与GenBank上多种α疱疹病毒同源蛋白的核酸和氨基酸序列具有较高的同源性。系统进化树分析表明,DPV UL47与禽类疱疹病毒(α-疱疹病毒)的进化关系最近。密码子偏爱性结果显示,DPV UL47编码相同氨基酸的不同密码子使用频率差异较大,UL47基因密码子使用模式更接近真核生物。研究结果为进一步开展DPV UL47基因功能研究奠定了基础。 相似文献
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应用PCR检测鸭肠炎病毒弱毒在鸡胚体内的分布 总被引：2，自引：0，他引：2
根据GenBank已发表的鸭肠炎病毒（DEV）UL6基因的部分核苷酸序列，设计并合成一对引物．以鸭肠炎病毒中国商品化疫苗毒蚀斑纯化株（DEV Clone-03）DNA为模板，经PCR扩增出预期516bp的目的片段。将此片段插入克隆载体质粒pMD18-T，并进行序列测定，序列比较结果显示，此段序列与参考序列完全一致。用PCR检测DEV Clone-03在鸡胚体内的分布情况显示，接毒死亡鸡胚的尿囊膜、心、肝、脾、肺、肾和肌肉皮肤内均存在病毒。PCR敏感试验表明此方法可以检测到100μL尿囊液中提取的10^-3稀释的病毒DNA，相当于0．2个EID50病毒量的DNA。 相似文献
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高丹草超低氢氰酸含量ISSR特征片段的克隆及序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为明确高丹草超低氢氰酸含量ISSR特征片段的DNA分子特征,以散穗高粱×黑壳苏丹草杂种F2的3个超低氢氰酸含量ISSR特征片段H-1、H-2、H-3和散穗高粱×白壳苏丹草杂种F2的3个超低氢氰酸含量ISSR特征片段B-1、B-2、B-3为材料,对6个不同的ISSR特征片段进行了克隆和测序分析.结果表明:克隆的特征片段H-1序列全长为1377bp,序列包含1个357bp的完整编码区(ORF),位于743～1099bp区域,共编码119个氨基酸,片段与小麦亚种蛋白b的同源性为60％.片段H-2序列全长2268bp,序列包含1个279bp的ORF,位于735～1013bp区域,共编码93个氨基酸,片段与高粱假设蛋白SORBIDRAFT_05g027190同源性为63.9％,与水稻粳稻组假设蛋白OsJ_07776同源性为62％.片段H-3序列全长2614bp,序列包含1个339bp的ORF,位于1024～1362bp区域,共编码113个氨基酸.片段B-1序列全长1432bp,序列包含1个300bp的ORF,位于700～999bp区域,共编码100个氨基酸.片段B-2序列全长1363bp,序列包含1个228bp的ORF,位于603～830bp区域,共编码76个氨基酸.片段B3序列全长2751bp,序列包含1个186bp的ORF,位于2534～2719bp区域,共编码62个氨基酸.片段H-3、B-1、B-2、B-3与现有已知的植物碱基序列和氨基酸序列没有同源性,可能是与高丹草超低氢氰酸含量关系更为密切的DNA新序列. 相似文献
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为了探讨鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)UL18基因的特性和功能,本研究运用生物信息学软件对DEV UL18基因及其编码蛋白进行了分析。构建原核表达质粒pET32a-UL18,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后获得了大小约为55 000的pET32a/DEV-UL18重组蛋白。将该重组蛋白纯化后免疫家兔,获得了兔抗pET32a/DEV-UL18重组蛋白高免血清。采用荧光定量RT-PCR和Western blot对DEV感染鸭胚成纤维细胞(DEF)后UL18基因的转录和表达情况进行检测,采用间接免疫荧光对DEV感染鸭的肠道和食道进行检测。生物信息学分析结果表明,DEV UL18基因大小969bp,编码1条由322个氨基酸残基组成的多肽,含15个潜在的磷酸化位点和2个N-糖基化位点,含15个潜在的B细胞表位;系统进化树分析表明,DEV UL18属于ɑ-疱疹病毒的1个成员,与MeHV-1亲缘关系最近;密码子偏爱性分析结果表明,若对DEV UL18基因进行外源表达,真核表达系统可能更容易,若选择原核表达系统,则需对宿主表达菌进行选择和条件优化。荧光定量RT-PCR和Western blot结果表明,DEV感染DEF后2h,UL18基因开始转录,感染后12h开始表达,感染24h后转录和表达产物急剧上升,到36和48h后转录和表达产物分别达最大值,之后逐渐下降。间接免疫荧光结果表明,被DEV感染鸭肠道、食道等组织能检测到明显的阳性信号,表明制备的DEV UL18原核表达蛋白及其兔抗多克隆抗体可用于DEV的诊断试剂材料。 相似文献
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鸭瘟病毒北京株UL6和UL7基因的克隆及序列测定 总被引：12，自引：0，他引：12
依据文献报道的鸭瘟病毒（DPV）的核苷酸序列，设计和合成了二对引物，分别为SP1和SP2，LP1和LP2。北京株鸭瘟病毒于鸭胚中增殖，差速离心和蔗糖密度梯度离心纯化，按酚－氯仿法抽提DNA。然后以DPV DNA为模板进行PCR，分别扩散增出与理论相符的421bp和1209bp的二个DNA片段，并将它们克隆于质粒pGEM-T Easy中。经酶切和质粒PCR，筛选含有目的基因的重组质粒。重组质粒以步移法从双方向测序，获1586bp的核苷酸序列。研究发现这1586bp的核苷酸序列与文献报道的UL6和UL7基因序列的同源性为99％，仅有一个碱基的差异。进一步作氨基酸分析，发现这个碱基所引起的变异为无意义突变（CCT→CCC）。结果表明，鸭瘟病毒的UL6和UL7基因在不同的毒株中高度保守。 相似文献
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鸭瘟病毒VP 26基因克隆和分子特性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
利用作者实验室已构建的DPV CHv株基因文库重组质粒的DNA测序信息,结合NCBI的ORF Finder和BLAST工具分析得到了编码该病毒VP26蛋白基因(UL35)的ORF,然后采用PCR扩增出了VP26基因并将其克隆到pMDl8-T载体上,经PCR和酶切鉴定以及进一步的核酸斑点杂交试验证实该基因即为DPV的VP26基因.分子特性分析表明:该基因大小为354 bp,编码117 aa,包含1个保守结构域,为Herpes_UL35,与小衣壳蛋白家族相关并在Herpes_UL35基因编码蛋白之间高度保守,而且DPV VP26蛋白与GenBank上多种a疱疹病毒同源蛋白的核酸和氨基酸序列具有较高的同源性.系统进化树分析表明,DPV在分类地位上归属于Alphaherpesvirus亚科,而且有可能属于新的属.另外,亚细胞定位分析表明,VP26主要定位于细胞核中.密码子偏爱性分析结果显示,编码VP26相同氨基酸的不同密码子使用频率有较大的差异,DPV VP26与大肠杆菌、酵母和人的密码子使用偏爱性差异分别有18、19和25个.上述研究结果为进一步研究DPV VP26蛋白的功能和作用机理提供分子生物学依据. 相似文献
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腺苷酸转移酶(adenine nucleotide translocase,ANT)是线粒体内膜上的转运蛋白家族成员。从柞蚕(An-theraea pernyi)蛹全长cDNA文库中获得了柞蚕腺苷酸转移酶基因(ApANT)的cDNA序列(GenBank登录号FJ788509)。对该基因进行生物信息学分析表明:ApANTcDNA全长1 282 bp,含有1个903 bp的开放阅读框(ORF)序列,编码300个氨基酸;ApANT与烟草天蛾(Manduca sexta)等鳞翅目昆虫的ANT基因在核苷酸和氨基酸序列水平分别具有80%和90%以上的同源性,说明ANT蛋白在这些昆虫中是高度保守的;与其它已知鳞翅目昆虫的ANT蛋白一样,ApANT蛋白含有3个线粒体穿膜结构域,并且这3个保守结构域之间也显示出较高的相似性。 相似文献
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本研究利用血清Ⅰ型马立克氏病病毒（Marek＇s disease virus serotype 1,MDV-1）被膜蛋白UL11原核表达产物作为免疫原,免疫小鼠制备多抗血清,通过间接免疫荧光试验,结果发现：UL11真核表达时,存在于COS-1和Sf9细胞浆中。而检测MDV的RB1B毒株感染CEF时,却发现UL11高度聚集于空斑中心,且可分布于空斑周围的所有细胞核中。这为研究UL11细胞核内扩散的分子机制,以明确UL11是否参与MDV-1致瘤的过程提供了参考。 相似文献
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论述了疱疹病毒UL34基因的序列特点、编码蛋白结构特点、基本功能以及它与UL31蛋白、Us3蛋白、动力蛋白、核纤层蛋白的相互作用。表明，UL34基因对病毒的早期包装、成熟和出芽以及对UL31蛋白和核纤层蛋白在感染细胞中的正确定位都具有重要作用。 相似文献
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UL14在α-疱疹病毒中相当保守,但其在伪狂犬病毒中的功能尚不清楚。本研究以伪狂犬病毒鄂A株（PRV-Ea）为亲本株,通过同源重组,将编码EGFP的真核表达盒插入到伪狂犬病毒基因组的UL14基因中,PCR检测和荧光观察证实获得了能稳定表达EGFP的UL14插入失活突变株PRV-UL14D。将PRV-UL14D感染IBRS-2细胞,发现该突变株较PRV-Ea野毒株增殖缓慢,而且PRV-UL14D突变株感染细胞后形成的蚀斑也明显小于PRV-Ea野毒株,但在稳定表达UL14的IBRS-2细胞系中,PRV-UL14D与PRV-Ea野毒株的增殖速度、形成的蚀斑大小均无明显差异。进一步将PRV-UL14D感染BALB/c小鼠,发现与相同剂量的PRV-Ea野毒株感染相比,小鼠平均死亡时间明显延缓。上述研究结果表明,UL14并非伪狂犬病毒增殖必需的,但其缺失可延缓病毒增殖,推测UL14可能与病毒粒子在细胞间的扩散有关。 相似文献
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UL36USP是马立克病毒UL36基因编码的蛋白UL36上具有去泛素化酶活性的N-端部分片段（UL36USP）,本试验以提取MDCC-MSB1细胞的基因组为模板通过PCR获得目的基因,将UL36USP基因克隆入pMD18T载体,测序正确并酶切鉴定后,将目的基因亚克隆到pET28a原核表达载体,构建重组质粒pET28a-UL36USP。将重组质粒转化BL21（DE3）E.coli中,IPTG诱导表达并使用Ni-NTA Agarose亲和层析进行纯化得到目的蛋白。应用纯化后的UL36USP免疫獭兔制备多克隆抗体。使用昆虫细胞表达系统表达的UL36片段检测多克隆抗体的特异性。结果显示成功制备特异性的UL36USP抗体。 相似文献
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伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)变异株(JS-2012株)在Vero细胞上40℃传代培养120代后,获得了1株弱毒株(JS-2012-F120株)。该毒株UL46基因3'端有29个碱基插入,导致了130个氨基酸突变。为了研究UL46基因移码突变对PRV生物学特性的影响,本研究用JS-2012-F120的ΔUL46基因替换了JS-2012的UL46基因,构建了重组病毒JS-2012-ΔUL46,并对该重组病毒、高温传代毒株(JS-2012-F120)及其亲本强毒株(JS-2012)在细胞上的生长特性和对小鼠的毒力进行了比较分析。结果显示,与亲本毒株(JS-2012)相比,传代毒株(JS-2012-F120)病毒滴度明显提高,对小鼠的毒力明显减弱;重组病毒(JS-2012-ΔUL46)在Vero细胞上的生长趋势没有明显改变,对小鼠的毒力减弱。因此,UL46基因移码突变对PRV在Vero细胞上的复制没有明显影响,但减弱了PRV对小鼠的毒力。 相似文献
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根据已经发表的伪狂犬病病毒(PRV)国内Ea株UL49基因序列,设计并合成了1对引物,通过PCR方法扩增到了PRV Bartha-K61株UL49基因的编码区,并克隆到pMD18-T载体中.重组质粒pMD-UL49经XhoI酶切和PCR鉴定后,进行了序列测定和分析.结果表明,重组质粒pMD-UL49含有PRV Bartha-K61株UL49基因的编码区.同源性分析显示,PRV Bartha-K61株UL49基因序列与国外Kaplan株、国内Ea株相应基因的核苷酸同源性分别为98.9 %和94.1 %,推导的氨基酸序列同源性分别为96.7 %和87.2 %. 相似文献
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通过生物信息学分析、斑点杂交实验、克隆和测序证实了本实验室构建鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)CHv株基因文库时新分离的基因(GenBank登录号EF643562)为DPV UL34基因,进一步运用有关分子生物学软件对该基因进行了分子特性分析。结果表明,该基因大小为831bp,编码276个氨基酸的多肽,含有疱疹病毒UL34类似蛋白家族保守区。系统进化树分析显示,其与α疱疹病毒亚科中马立克病毒属的GaHV-2,GaHV-3,MeHV-1,EHV-1和水痘病毒属的CeHV-9,HHV-3的亲缘关系最近,揭示DPV-CHv株应该被划为α疱疹病毒亚科中的单独一类。该编码蛋白在252～274位氨基酸有一个明显的跨膜区,C末端有一微体靶向序列(ARL),但无信号肽;含有4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,3个蛋白激酶C磷酸化位点,5个N-豆蔻酰化位点和1个N-糖基化位点;亚细胞定位主要位于细胞核;密码子偏爱性分析显示其偏爱的密码子第3位碱基多以A和T结尾,属于低表达基因;不同密码子使用频率与酵母、大肠杆菌和人的密码子使用频率比较表明,其与大肠杆菌和酵母较接近,与人差异较大。该分析结果揭示DPV UL34基因为一C端锚定的Ⅱ型膜蛋白基因,体外表达选择大肠杆菌和酵母表达系统较为合适,同时该结果也为进一步开展DPV UL34基因的生物学功能研究具有一定的参考作用。 相似文献