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1.
《畜牧与兽医》2021,(6)
为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的单克隆抗体,以原核表达的重组p30蛋白为免疫原免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA方法筛选,获得2株能稳定分泌抗ASFV p30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2株杂交瘤细胞从第10代开始均能稳定分泌抗体,细胞上清抗体效价均为1∶6 400。亚型鉴定结果显示,2株单克隆抗体的重链均属于IgG1,轻链均为κ型。Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,2株单克隆抗体均能与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞发生特异性反应。试验结果为p30蛋白生物学和诊断方法研究提供了技术支持。 相似文献
2.
【目的】表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)p72蛋白,并制备其单克隆抗体。【方法】构建原核表达载体pET-28b-p72,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行诱导表达和蛋白纯化;用纯化后的p72蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合并制备单克隆抗体,通过间接ELISA法和亚克隆筛选出分泌抗体的阳性杂交瘤细胞;通过小鼠抗体类型检测试剂盒检测抗体类型;通过体内诱生法制备抗ASFV p72蛋白的单克隆抗体腹水,使用饱和硫酸铵沉淀法进行抗体纯化,通过间接ELISA法、间接免疫荧光试验(IFA)和Western blotting检测单克隆抗体效价和特异性。【结果】ASFV p72重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达,将纯化的p72蛋白制备单克隆抗体,获得4株分泌IgG1抗体的单克隆细胞株,分别命名为6F8、7C3、8H7和9G2。间接ELISA结果显示,6F8与8H7细胞株分泌的抗体效价均为1∶64 00,7C3与9G2细胞株的抗体效价均为1∶12 800,且4株细胞株分泌的抗体与p72蛋白反应结果均呈... 相似文献
3.
为制备牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gD蛋白单克隆抗体,并对其免疫学特性进行分析与鉴定。用CHO细胞表达的IBRV-gD蛋白作为免疫原免疫8周龄的Balb/c小鼠,无菌取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞株,经小鼠腹腔注射,待小鼠腹腔膨胀后,收集腹水,纯化后进行单克隆抗体浓度、纯度、类及亚类、抗体效价、相对亲和常数、Western blot和间接免疫荧光测定。结果表明,筛选到2株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为4G3D4和9D7A7。4G3D4和9D7A7这2株单抗纯化后的浓度分别为2.6 mg/mL、1.6 mg/mL;亲和常数分别为2.30E+10、1.88E+09;抗体亚类均为IgG1,轻链为kappa链;且均能与IBRV发生特异性反应,与接种IBRV的MDBK细胞发生反应,产生特异性荧光;间接ELISA测定腹水效价分别为1∶204800、1∶12800。利用CHO细胞表达的IBRV-gD蛋白成功制备了2株单克隆抗体,为下一步建立特异性的IBRV检测方法奠定了基础。 相似文献
4.
分别用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和纯化的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体(McAb)。用纯化的PRRSV免疫小鼠,经细胞融合获得2株可分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为4B8、4D8。用重组N蛋白免疫的小鼠,经细胞融合获得3株可分泌特异性McAb的抗PRRSV N蛋白的杂交瘤细胞2F3、4D5、5D11。间接ELISA检测4D8、4B8、4D5和5D11杂交瘤上清效价为1∶32~1∶512,而2F3的腹水效价为1∶12 800。单抗2F3、4B8和4D8与纯化病毒的Western blotting反应都为阳性,而4D5和5D11为阴性。IFA检测结果5株单抗都有明显的荧光,与PRRSV呈阳性反应。2F3的Ig亚型为IgM。5株单抗杂交瘤细胞连续传代至20代,分泌相应McAb的效价基本一致。本研究为PRRSV生物学诊断和方法研究提供有用工具。 相似文献
5.
猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体制备与鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
为获得猪伪狂犬病毒(PRV)gE蛋白单克隆抗体,选择原核表达的重组gE蛋白免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,将其脾细胞与SP2/0进行融合,经间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,结果获得了2株能稳定分泌抗PRV gE蛋白的杂交瘤细胞,命名为E3B8和E5C11。间接ELISA检测2株杂交瘤细胞的培养上清液抗体效价为1∶6.4×10~3,腹水的抗体效价分别达到1∶3.28×10~6和1∶6.55×10~6。2株杂交瘤细胞的染色体数分别为105和108。E3B8亚类鉴定重链为IgG1,轻链为κ链;E5C11亚类鉴定重链为IgG2b,轻链为κ链。Western blot检测显示2株单克隆抗体腹水均能与PRV重组gE蛋白发生特异性反应,间接免疫荧光试验(IFA)检测显示2株单克隆抗体均能与PRV分离毒株感染的BHK-21细胞发生特异性反应,交叉反应性检测显示2株单克隆抗体与常见病毒不发生交叉反应。表明制备的2株gE蛋白单克隆抗体效价高、特异性强,为gE蛋白结构与功能分析以及PRV免疫诊断试剂盒的开发奠定了基础。 相似文献
6.
为获得抗猪分泌型IgA(SIgA)的单克隆抗体(MAb),本研究以纯化的SIgA蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,通过间接ELISA方法筛选出1株稳定分泌抗SIgA SC片段的杂交瘤细胞株,命名为2F9。MAb亚类鉴定结果显示其亚类为IgG1/κ链。杂交瘤细胞培养上清液和腹水的效价分别为1∶200和1∶16 000。Western blot鉴定显示该MAb能够识别天然SIgA蛋白;IFA显示该MAb可以识别真核细胞表达的SIgA SC蛋白。抗猪SIgA SC片段的MAb制备,为建立一系列猪消化道病原的特异性SIgA诊断方法及研究黏膜免疫提供了重要工具,具有广阔的应用前景。 相似文献
7.
《畜牧与饲料科学》2017,(9)
以饱和硫酸铵沉淀法和Agarose-Protein G亲和层析技术相结合从银狐血清中提纯免疫球蛋白(IgG),再经SDS-PAGE电泳鉴定,将纯化的免疫球蛋白(IgG)作为抗原,采用常规方法免疫BALB/c小鼠,3次免疫后取脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞相融合制备杂交瘤细胞,利用间接ELISA、Western blot等方法进行鉴定及阳性克隆的筛选,对杂交瘤细胞产生的单克隆抗体进行鉴定和活性测定。结果得到与银狐免疫球蛋白(IgG)发生特异性反应的3株单克隆抗体,分别命名为E2、1E3和2G10。Western blot结果表明,E2、1E3和2G10单克隆抗体能与银狐IgG蛋白特异性结合。经抗体亚型鉴定E2、1E3和2G10均为IgG1、Kappa链。生产提纯的腹水单克隆抗体经Western blot分析效价可达到1∶6 000。该研究利用抗银狐IgG单克隆抗体制备检测感染主要传染病的银狐血清抗体试纸条具有良好的特异性与灵敏性,可以作为检测银狐主要传染病的一种新方法。 相似文献
8.
《畜牧与兽医》2021,(10)
为了制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)p11.5蛋白的特异性单克隆抗体,利用大肠杆菌表达系统,将密码子优化后的ASFV p11.5基因序列连接表达载体pET28a-SUMO,构建pET28a-SUMO-p11.5原核表达质粒,获得了可溶性的ASFV p11.5蛋白。经Western blot鉴定,重组ASFV p11.5蛋白可被ASFV标准阳性血清特异性识别,表明其具有良好的反应原性。将纯化后的p11.5蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞法,制备了4株可稳定分泌抗ASFV p11.5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。3株单克隆抗体重链亚类为IgG1,1株重链亚类为IgG2a,轻链亚类均为κ。采用p11.5蛋白为包被抗原的间接ELISA方法检测单克隆抗体的效价均不低于1∶102.4×10~4。经间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,4株单克隆抗体,均不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒发生交叉反应,但均能与ASFV反应,表明单克隆抗体具有良好的特异性和反应性。本试验为p11.5蛋白结构功能、免疫学特性及ASFV诊断试剂产品的研究提供了重要的生物材料。 相似文献
9.
将鸡白细胞介素18成熟蛋白(mature chicken interleukin 18,mChIL-18)基因亚克隆至原核表达载体pET-28a(+),并在大肠杆菌中高效表达,采用Ni-NTA亲和层析方法纯化重组蛋白,免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选制备特异性单克隆抗体(mAb),并通过间接ELISA、间接免疫荧光(IFA)和Western blot等方法对mAb做初步鉴定.结果表明,试验成功表达了mChIL-18蛋白,并获得2株持续且稳定分泌抗体的杂交瘤细胞(1G9、2E6),其腹水ELISA效价分别为1∶5.12×10 5和1∶3.2×104,亚类鉴定结果均为IgM.Western blot结果显示,2株单抗均能特异性识别原核表达的mChIL-18蛋白,IFA分析表明它们均能与真核表达的mChIL-18发生特异性反应,ELISA叠加试验证实1G9与2E6针对2个不同的抗原表位.本研究所获单抗可以用于建立鸡IL-18的检测方法,为进一步开展其生物学功能研究奠定了基础. 相似文献
10.
为获得新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV） M蛋白单克隆抗体,本研究将编码该蛋白的基因克隆、表达并纯化重组蛋白,作为免疫原免疫小鼠,同时建立ELISA筛选方法对小鼠血清效价进行测定,筛选出血清抗体效价最高的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,最终获得能稳定产生NDV M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并进行了抗体的免疫荧光、Western blotting、亚类的鉴定、杂交瘤细胞染色体计数、小鼠腹水制备及腹水内单克隆抗体效价测定。结果显示,PCR、重组质粒测序及双酶切鉴定正确,M基因大小约为1 095 bp。SDS-PAGE和Western blotting检测显示,试验成功表达了重组M蛋白,分子质量约为60 ku,且可与NDV阳性血清反应。建立的ELISA筛选方法中,重组M蛋白、His标签蛋白和抗体的最佳工作浓度分别为0.5 μg/mL、0.5 μg/mL和1∶256 000。抗体的免疫荧光、Western blotting、亚类的鉴定显示,杂交瘤细胞产生的抗体可与NDV SG10株及重组M蛋白特异性结合,其轻链为κ,重链为IgG2A。C9-G2、D3-F2杂交瘤细胞染色体计数结果分别为97和101条;杂交瘤细胞上清的ELISA检测效价均为1∶6 400,腹水的ELISA检测效价分别为1∶409 600和1∶102 400。本研究成功制备了NDV M蛋白的单克隆抗体,可为进一步研究M蛋白的功能提供工具。 相似文献
11.
用杆状病毒表达系统表达虾源副溶血性弧菌编码蛋白PirB的重组蛋白,用SDS-PAGE、Western blot对其进行鉴定,纯化后的PirB重组蛋白免疫Balb/c小鼠后进行细胞融合,通过间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,用ELISA方法对单克隆抗体进行测定。结果发现,共筛选到7株能够稳定分泌抗PirB蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,小鼠腹水的效价最高效价达到1∶2.56×106,制备的单克隆抗体可以特异性识别PirB蛋白,表明成功制备了虾源副溶血性弧菌PirB蛋白单克隆抗体,为虾源副溶血性弧菌引发的疾病诊断奠定了基础。 相似文献
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猪链球菌2型人源分离株EF单克隆抗体的制备与鉴定 总被引：3，自引：1，他引：2
为了解猪链球菌2型（SS2）菌株毒力相关因子的致病机理,建立高效的免疫学检测方法,将SS2胞外因子（EF）抗原性强的区域通过基因克隆、原核表达,经亲和层析纯化的EF蛋白免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术将免疫细鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,建立了4株分泌抗EF蛋白单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞系2G1、5H7、3H4和1F2。间接ELISA测定杂交瘤细胞培养上清的效价为1∶128～1∶512,诱生腹水的抗体效价为1∶104～1∶105。4株McAb腹水的Western blot鉴定表明McAb能特异性的识别EF。以2G1单抗腹水与和EF多克隆抗血清建立的夹心ELISA可特异地检测EF。 相似文献
13.
旨在制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白的特异性单克隆抗体。本研究利用大肠杆菌表达系统表达p54蛋白,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。利用纯化的p54蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞。经4次亚克隆后,取杂交瘤细胞上清进行单克隆抗体亚型鉴定,利用体内诱生法制备单克隆抗体并进行纯化。间接ELISA方法检测单克隆抗体的效价,利用交叉反应性试验、间接免疫荧光试验和蛋白印迹对所获单克隆抗体的特异性进行鉴定。根据预测的p54蛋白二级结构,采用逐步截短法分析鉴定单克隆抗体识别的抗原表位区域,并在p54的三级结构中进行标注。结果显示：成功筛选了6株分泌p54单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为28G12-1、31G7-1、31G7-2、35F10-1、35F10-2、38D3-1。其中28G12-1、31G7-1、31G7-2重链为IgG2a型,35F10-1、35F10-2、38D3-1重链为IgG1型;轻链均为κ链。单克隆抗体的最低效价为1∶25 600,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪急性腹泻综... 相似文献
14.
利用PCR技术从质粒pSHIV89．6P中扩增猴免疫缺陷病毒（SIV）衣壳蛋白p27基因,并将其插入表达载体pET32a（＋）构建重组质粒pET32a-p27,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,对其产物进行SDS-PAGE和Western blot分析,并将纯化定量后的表达产物免疫小鼠,制备单克隆抗体。结果显示,gag基因的p27相应片段为763bp,其表达产物相对分子量为46ku。经镍柱纯化,获得目的蛋白p27纯度可达90％以上。利用淋巴细胞杂交瘤技术获得5株稳定分泌抗p27的单克隆抗体细胞株,分别命名为1A5、1C7、3C2、2D12、3D12。5株杂交瘤细胞诱生小鼠产生的腹水抗体效价分别为1：12800、1：25600、1：819200、1：51200和1：409600。免疫球蛋白类型均为IgG1型,轻链均为入链。Western blot和IFA试验结果表明所获得的单克隆抗体均对病原检测具有很高的特异性,为进一步开发SW早期诊断试剂盒奠定了基础。 相似文献
15.
利用纯化灭活的猪源脑心肌炎病毒(EMCV)免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,研制获得4株能稳定分泌抗EMCV抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1D1、2A2、2B6和4E2。经ELISA测定,细胞培养上清中抗体效价分别为1∶1 600,1∶6 400,1∶6 400和1∶3 200,小鼠腹水抗体效价分别为1∶1.63×106,1∶3.28×106,1∶1.13×106和1∶5.63×105。1D1和2A2单抗亚类为IgG1,2B6和4E2单抗亚类为IgG2b,轻链均为κ型。Western blot结果表明,1D1、2A2和4E2能特异性识别病毒的VP1蛋白,2B6能特异性识别病毒的VP2蛋白。间接免疫荧光试验证明,4株单抗具有良好的特异性,均能识别EMCV。本研究获得的4株特异性单抗,将为EMCV诊断方法的建立和病毒蛋白功能的研究奠定基础。 相似文献
16.
为了制备猪IL-10的单克隆抗体(MAb),本研究根据GenBank登录的猪白细胞介素10(PIL-10)基因序列设计两对特异性引物,利用套式PCR扩增PIL-10成熟蛋白编码基因(490bp),构建原核表达载体pET28a-PIL-10,并转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,SDS-PAGE和western blot分析鉴定,证明PIL-10重组蛋白获得表达。提取纯化该重组蛋白包涵体,免疫BALB/c小鼠,经过3次细胞融合,间接ELISA方法筛选,获得一株能稳定分泌抗猪IL-10MAb的杂交瘤细胞,将其命名为2F4。Western blot结果证明该MAb能够与重组蛋白发生特异性反应。间接ELISA测定细胞上清抗体效价为1∶1024,腹水效价为1∶128000,该MAb为IgG3亚型,轻链为λ型。杂交瘤细胞连续传代20代,分泌抗体的效价基本一致,从而为进一步建立猪IL-10的检测方法奠定了物质基础。 相似文献
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为制备禽传染性支气管炎病毒(IBV) S2蛋白的单克隆抗体(MAb)，本研究通过原核表达系统表达并纯化重组S2蛋白，将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到4株能够稳定分泌S2蛋白MAb的杂交瘤细胞株，分别命名为1A7、4F12、4A7、4D1。亚类鉴定结果显示4株MAb的重链均为Ig G1，轻链均为κ。采用间接ELISA法检测上清及腹水效价，结果显示MAb细胞上清效价均不低于1∶12 800，腹水效价均不低于1∶51 200。采用western blot检测制备的S2蛋白MAb与IBV感染鸡胚尿囊液后天然表达的S2蛋白的反应原性；采用间接免疫荧光试验(IFA)检测IBV感染非洲绿猴肾细胞(Vero)后天然表达的S2蛋白的反应原性。Western blot结果显示，感染IBV的鸡胚尿囊液中出现了90 ku左右的特异性条带；IFA结果显示，感染IBV的Vero细胞中出现绿色荧光。以上结果表明，制备的S2蛋白MAb能够与天然表达的S2蛋白反应，反应原性较强。利用间接ELISA检测MAb与S2蛋白的亲和力，结果显示4株MAb对S2蛋白均有良好的亲和力。利用一系列表达部分重叠的重... 相似文献
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《畜牧与兽医》2018,(12)
为了制备H5N6亚型禽流感病毒(AIV)的单克隆抗体(MAb),采用纯化的H5N6 AIV免疫BALB/c鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA方法进行筛选,获得2株能稳定分泌抗NP蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为3D9和2B10。间接ELISA检测2株杂交瘤细胞培养上清液抗体效价分别为1∶1×10~3和1∶1×10~4,腹水的抗体效价分别达到1∶1×10~5和1∶1×10~6; 3D9和2B10亚类鉴定重链为IgM,轻链为κ链; Western blot分析表明,2株杂交瘤细胞上清均能与不同的AIV感染的尿囊液在56 kD处发生特异性反应,并能与原核表达的重组NP蛋白发生特异性反应;间接免疫荧光试验显示,2株单克隆抗体均能与不同的AIV感染的MDCK细胞产生特异性反应。以上结果表明,本研究针对H5N6 AIV的NP蛋白制备了2株单克隆抗体,且都具有较好的特异性、保守性和广谱性,为今后禽流感诊断方法的开发奠定了基础。 相似文献
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以纯化的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S蛋白中和表位(SID)重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术获得了6株稳定分泌抗SID区特异性的单克隆抗体细胞株,分别命名为2C4、3G3、5F8、3G5、6E6和3C3。6株杂交瘤细胞诱生小鼠产生的腹水抗体效价分别为1∶51200、1∶6400、1∶12800、1∶6400、1∶51200和1∶25600。免疫球蛋白类型均为IgG1型,轻链均为Κ链。Western blot试验结果显示,6株单克隆抗体均能特异性地识别天然PEDV中的S蛋白。 相似文献
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《畜牧与兽医》2020,(10)
为制备针对犬细小病毒(CPV)的单克隆抗体,以纯化的CPV免疫BALB/c小鼠,3次免疫后,取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。利用超速离心纯化的病毒作为包被抗原,采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,获得3株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1D9、3G9和4F6。单克隆抗体细胞培养上清效价为1∶64、1∶64、1∶128,腹水效价为1∶10~4、1∶10~4、1∶10~5。3株杂交瘤细胞的染色体数分别为92、94、98。亚类鉴定结果显示1D9和3G9重链为IgG1,4F6重链为IgG2b,轻链均为kappa链。病毒中和试验表明,单克隆抗体4F6对CPV具有明显的病毒中和活性。交叉试验表明,3株单克隆抗体均可与CPV特异性结合,与其他犬类常见病毒无交叉反应。本研究制备的单克隆抗体为CPV的检测及其感染动物的治疗提供了物质基础。 相似文献